[发明专利]CRISPR-Cas核酸内切酶在植物基因组工程中的应用

权利要求书

1.一种用于修饰植物细胞中至少一个染色体基因或染色体外基因表达的方法，所述方法包含将以下项引入所述细胞中：

(a)(i)成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活的crRNA(tracrRNA)，或(ii)嵌合的cr/tracrRNA杂合体(sgRNA)，其中所述crRNA或sgRNA包含与该基因内的或由该基因编码的RNA分子内的靶序列互补的序列；以及

(b)CRISPR/CasX核酸内切酶分子，其中所述CRISPR/CasX核酸内切酶能够在所述crRNA或sgRNA所靶向的序列处、所靶向的序列之内或所靶向的序列附近引入双链断裂或单链断裂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述crRNA包含约23个核苷酸的重复序列和约20个核苷酸的间隔区序列，其中所述间隔区序列与所述靶核酸相互作用。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述crRNA或tracrRNA或sgRNA包含非常规和/或修饰的核苷酸和/或包含非常规和/或修饰的主链化学成份。

4.根据权利要求3所述的方法，其中crRNA或tracrRNA或sgRNA包含一种或多种修饰，所述修饰选自：锁核酸(LNA)碱基、主链中的核苷酸间硫代磷酸酯键、2’-O-甲基RNA碱基、解锁核酸(UNA)碱基、5-甲基dC碱基、5-羟基丁炔-2’-脱氧尿苷碱基、5-硝基吲哚碱基、脱氧肌苷碱基、8-氮杂-7-脱氮鸟苷碱基、5’末端处的双脱氧-T、3’末端处的反向dT以及和3’末端处的双脱氧胞苷。

5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中将所述crRNA、tracrRNA或sgRNA作为编码所述RNA并与指导所述RNA在细胞中产生的启动子可操作地连接的DNA分子引入所述细胞中。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/CasX核酸内切酶分子是δ变形菌(Deltaproteobacteria)核酸内切酶或其突变体或衍生物。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/CasX核酸内切酶分子包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少85％序列同一性的序列。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述CRISPR/CasX核酸内切酶分子是浮霉菌(Planctomycetes)核酸内切酶或其突变体或衍生物。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/CasX核酸内切酶分子包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少85％序列同一性的序列。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/CasX核酸内切酶分子被修饰以使其在不同于修饰前的最佳温度的温度具有活性。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述修饰的CRISPR/CasX核酸内切酶分子在适合于植物或植物细胞的生长和培养的温度具有活性。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述修饰的CRISPR/CasX核酸内切酶分子在约20℃至约35℃的温度具有活性。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述修饰的CRISPR/CasX核酸内切酶分子在约23℃至约32℃的温度具有活性。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述修饰的CRISPR/CasX核酸内切酶分子在约25℃至约28℃的温度具有活性。