[发明专利]利用双光子荧光测定法确定蛋白质结构的方法

权利要求书

1.一种用于确定附接到拴系的生物分子的双光子荧光标签的角度参数的方法，所述方法包括：

(a)以定向方式将生物分子附接到一平面表面，其中在已知位点，用双光子荧光标签来标记所述生物分子；

(b)使用第一偏振以第一基频的激发光照射所述附接的生物分子；

(c)检测由于步骤(b)中的所述照射而由所述双光子荧光标签生成的光的第一物理性质；

(d)使用第二偏振以所述第一基频的激发光照射所述附接的生物分子；

(e)检测由于步骤(d)中的所述照射而由所述双光子荧光标签生成的光的第二物理性质；以及

(f)比较步骤(e)中检测到的光的所述第二物理性质与步骤(c)中检测到的光的所述第一物理性质，以确定所述双光子荧光标签相对于所述平面表面的角度参数。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一物理性质是p-偏振光强度I_p，所述第二物理性质是s-偏振强度I_s，并且步骤(f)中的所述比较包括求解以下方程以确定角度参数：

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，进一步包括对两个或更多个不同生物分子缀合物的系列中的每一个重复步骤(a)至(f)，其中所述系列中的每个所述生物分子缀合物包括用相同的双光子荧光标签在不同位点标记的所述生物分子，并使用对所述两个或更多个不同生物分子缀合物各自确定的所述角度参数来确定所述生物分子的结构。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物分子是蛋白质，并且其中所述两个或更多个不同生物分子缀合物的系列各自包括单位点半胱氨酸或蛋氨酸取代。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在两个或更多个不同位点，所述生物分子被两个或更多个不同的双光子荧光标签标记，其中在被对于所述两个或更多个不同的双光子荧光标签而言相同或不同的基频的光照射后，在步骤(c)和(e)中同时或依次检测由所述两个或更多个不同的双光子荧光标签各自生成的光的第一物理性质和第二物理性质，并且其中对于所述两个或更多个不同的双光子荧光标签中的每一个，比较在步骤(e)中检测到的所述光的所述第二物理性质与在步骤(c)中检测到的所述光的所述第一物理性质，以确定所述两个或更多个不同的双光子荧光标签中的每一个相对于所述平面表面的角度参数。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在已知位点，还用二次谐波(SH)-活性标签、和频(SF)-活性标签或差频(DF)-活性标签来标记所述附接的生物分子。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述双光子荧光标签和第一二次谐波(SH)-活性标签、和频(SF)-活性标签或差频(DF)-活性标签是附接到所述生物分子上的相同已知位点的相同标签。

8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其进一步包括同时或依次检测在步骤(c)中由所述二次谐波(SH)-活性标签、和频(SF)-活性标签或差频(DF)-活性标签生成的光的第一物理性质，以及在一第二基频的激发光照射下在步骤(e)中由所述二次谐波(SH)-活性标签、和频(SF)-活性标签或差频(DF)-活性标签生成的光的第二物理性质，所述第二基频可以与所述第一基频相同或不同。

9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括比较在步骤(e)中检测到的所述光的所述第二物理性质与在步骤(c)中检测到的所述光的所述第一物理性质，以确定相对于所述平面表面的所述二次谐波(SH)-活性标签、和频(SF)-活性标签或差频(DF)-活性标签的角度参数。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其进一步包括将一个或多个双光子荧光标签、二次谐波(SH)-活性标签、和频(SF)-活性标签或差频(DF)-活性标签或其任何组合的所述角度参数的数据全局地拟合到所述生物分子的结构模型，其中所述结构模型包括有关所述生物分子内所述一个或多个标签的所述已知位点信息。