[发明专利]使用多能干细胞的免疫细胞的分化

说明书

本发明涉及通过使用多能干细胞来诱导造血干细胞或巨噬细胞的分化的方法、以及用于诱导分化的组合物。具体地，涉及在多能干细胞中包含骨形态发生蛋白4的用于诱导分化造血干细胞的组合物、或包含骨形态发生蛋白4及巨噬细胞集落刺激因子的用于诱导分化巨噬细胞的组合物、使用它们诱导分化的方法。本发明的优点在于，由于诱导分化的方法中使用的细胞因子的种类少，分化方法简单，因此与现有诱导分化的方法相比，分化效率提高了数十倍且分化的细胞的收率高。

技术领域

本发明涉及从多能干细胞分化诱导造血干细胞或巨噬细胞分化的方法及其用于诱导分化的组合物。所分化的造血干细胞还可以分化为巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞等的骨髓(myeloid)类细胞。

本发明的诱导分化的方法的特征在于，在从多能干细胞分化巨噬细胞的步骤中，不形成拟胚体(embryonic body)(细胞聚集体(aggregate))，而是直接分化。并且，通过使用阶段性处理用于诱导分化的添加物、排除抑制分化的组合物的方法、将白蛋白聚乙烯醇必需脂质(APEL)用作分化用基本培养基的方法等，来与已知方法相比，具有优异的收率。

背景技术

多能干细胞是指能够分化为人体所有细胞的未分化状态的干细胞。自1990年代后期建立人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)之后正式开始的干细胞领域的研究自2000年代中期在制备诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)方面取得突破性业绩以来，取得了飞跃性发展。并且，最近在建立人体细胞核移植胚胎干细胞(human somatic-cell nuclear transfer ESCs，hSCNT-ESCs)方面的成功活跃了对干细胞领域的进一步研究。

在这种使用干细胞的研究领域中，正在进行关于在细胞培养中将细胞分化为所需的种类的方法的研究，尤其正在进行更有效分化它们的方案的研究作为主要问题。未分化状态的干细胞随着分化而失去干细胞的特性，并逐渐具有分化的细胞原有特性，在此过程中，形态发生素(morphogen)及生长因子(growth factor)等的各种信号物质根据发生步骤依次且组合工作。通过将这些因子添加到培养中的干细胞培养液中来诱导分化。

先天性免疫反应是保护我们的身体免受外部入侵病原体侵害的第一道防线，也称为非特异性免疫。中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等参与先天性免疫反应，先天性免疫反应的开始与病原体的种类或是否存在感染经历无关。

巨噬细胞作为负责先天性免疫反应的细胞，遍布全身。大部分巨噬细胞具有粘性，并包含尘埃细胞、小胶质细胞、库珀细胞、朗格汉斯细胞等，当它们识别抗原时，将抗原吞噬，或分泌毒素以破坏抗原，通过向淋巴细胞传递抗原以触发免疫反应。巨噬细胞以未分化的单核细胞(monocyte)存在于某些血液中，单核细胞可根据需要分化为树突状细胞或巨噬细胞，并且所述各种信号物质参与巨噬细胞的分化。

像这样，可通过诱导多能干细胞的分化来获得所需细胞，尤其，如本发明的分化为免疫细胞可以用于各种疾病诊断或药物筛选方法。由此，需要开发可以提高分化效率及最终细胞的收率的新型诱导干细胞分化的方法及用于诱导分化的组合物。

因此，本发明人为了开发出通过改进之前开发的方案来以高效率诱导造血干细胞或巨噬细胞的的分化的方法，确认了使各种基本培养基通过测试、细胞因子组成的变化、信号传递物质的顺序调节等来从多能干细胞经造血干细胞成功诱导分化为巨噬细胞的方法，并以此完成了本发明。

通过确认由本发明的新型诱导分化的方法生产的巨噬细胞具有与人类中存在的巨噬细胞非常高的相似性，从而能够以多种方式利用。

现有专利文献

非专利文献

Meguma K.Saito等，Plos One，Published:April 3，2013(https://doi.org/10.1371/journal.pone.0059243)