[发明专利]核酸检测方法及检测用试剂

说明书

本发明提供一种迅速检测核酸的方法。核酸检测方法是从含有靶标核酸的流体中检测靶标核酸的核酸检测方法，其具备将具有第一核酸剪切酶和第二核酸剪切酶的检测用试剂混合到所述流体中的检测用试剂混合工序，利用所述第一核酸剪切酶将通过所述靶标核酸与具有第一侧翼部位的第一核酸及第二核酸形成复合物而显现的第一侵入结构所附带的所述第一侧翼部位剪切，生成第三核酸，利用所述第二核酸剪切酶将通过所述第三核酸与具有第二侧翼部位的第四核酸形成复合物而显现的第二侵入结构所附带的所述第二侧翼部位剪切，生成被剪切物。

技术领域

本发明涉及核酸检测方法。更详细地说涉及在能够与成为检测对象的核酸试样形成复合物的检测核酸及核酸剪切酶的存在下来检测有无成为检测对象的核酸的方法。

本申请基于2017年7月31日在日本申请的特愿2017-148402号主张优先权，将其内容援引在此。

背景技术

在基因诊断中，存在很多准确且迅速地对DNA进行检测和/或定量的手法(专利文献1～3、非专利文献1，2)。对RNA进行检测和/或定量的手法虽然有，但需要逆转录反应等工夫和时间。另外，还有逆转录反应的偏差。因此，为了能够用较少的操作即可在短时间内进行RNA检测，考虑到利用等温扩增反应。其中，使用被称为Flapendo nuclease 1(FEN-1，侧翼核酸内切酶-1)或5’-Nuclease(5’-核酸酶)的核酸剪切酶的Invasive Cleavage Assay(侵入裂解分析，ICA)由于操作性和反应的稳定性而被称作有效的手法。

但是，在为使用了FEN-1的ICA时，虽然会识别DNA/DNA双链上的侵入结构而发生侧翼(Flap)部位的剪切反应，但在为RNA/DNA双链时，剪切反应仅仅稍有发生。另一方面，在为使用了同为核酸剪切酶的5’-核酸酶的ICA时，虽然能够识别RNA/DNA双链上的侵入结构而发生侧翼部位的剪切，但在为DNA/DNA双链时，剪切活性降低。进而，5’-核酸酶的DNA/DNA双链时的侧翼剪切活性远远差于FEN-1。

因此，对于DNA/DNA双链、RNA/DNA双链混在这样的反应体系，在任何侧翼部位均想剪切时，若仅使用FEN-1或仅使用5’-核酸酶，则整体上的剪切活性会降低。

例如，在以某个核酸为靶标的检测反应中，当想要以高的效率放大检测信号时，使用2种剪切反应混在的手法。即，作为第一阶段发生侧翼的剪切，作为第二阶段将与所剪切的侧翼进一步形成侵入结构的检测用核酸剪切，然后对该剪切产物进行检测的手法。在第二阶段的反应结束后，由于侧翼可以再次用于第一阶段或第二阶段的反应，因此相比较于检测第一阶段的侧翼，信号放大变得迅速。

此时，若检测对象为DNA、检测用核酸也为DNA，则利用仅使用FEN-1的ICA即可检测。但是，在检测对象为RNA时，检测用核酸无论是DNA还是RNA，由于前面所述的各种酶的特性，整体上的剪切活性会降低，检测所需要的时间增加。另外，对于所述的RNA/DNA，虽然5’-核酸酶具有侧翼剪切活性，但存在因酶的错误识别所导致的副反应。因此，如果试图缩短检测时间而增加酶量，则副反应的发生频率增加，使检测结果的准确判定变得困难。

为了改善这种状况，以往报道了将在同一反应溶液内实施的所述的第一阶段和第二阶段分离的手法(非专利文献3、4)。具体地说为以下的手法：以作为核酸剪切酶为5’-核酸酶、核酸为靶标RNA、以及形成侵入结构所需的2种寡聚DNA的构成来制备仅第一阶段进行的反应溶液。在使第一阶段进行到某个程度之后，作为第二阶段，添加检测用核酸，且还同时添加被命名为阻断寡聚物的寡聚RNA，从而抑制因酶的错误识别所导致的副反应。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4016050号公报

专利文献2：日本专利第4362150号公报

专利文献3：日本专利第4363988号公报

非专利文献