[发明专利]靶向基因破坏方法及免疫原性组合物

说明书

对专性细胞内细菌中特定基因的靶向干扰及其随后的恢复仍然是极其挑战性的，因为专性细胞内细菌为了复制绝对需要驻留在宿主细胞内。此处，构建了靶向等位基因交换突变以使立克次氏体病原体，查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)的两个基因失活并然后恢复这两个基因中的一个。然后这些方法也在犬埃立克体(Ehrlichia canis)和嗜吞噬细胞无形体(anaplasma phagocyophilum)中被成功地利用。所得的突变的病原体被用于免疫原性组合物中以便降低立克次氏体属病原体感染的发生或严重性。

本发明是在NIH拨款号AI070908下在政府支持下进行的。政府在本发明中拥有某些权利。

发明背景

破坏专性细胞内细菌中的特定基因功能并随后恢复其活性仍然极具挑战性，因为专性细胞内细菌为了复制绝对需要驻留在宿主细胞内。此处，我们通过对立克次氏体病原体查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)的两个基因的等位基因交换创建了靶向突变，并基因互补了一个基因。原则上，该方法可以应用于其他专性细胞内细菌，并且将能够在细胞内细菌中常规地进行结构功能分析。该方法还适用于产生专性细胞内细菌的减毒株，这在用作活的疫苗候选物时将是有价值的。

专性细胞内细菌(以下简称“专性菌”)造成了全球数百万人的多种疾病。它们包括立克次氏体目(Rickettsiales)和衣原体目(Chlamydiales)的许多致病性革兰氏阴性菌。缺乏有效的对埃立克体属(Ehrlichia)、无形体属(Anaplasma)、立克次氏体属(Rickettsia)、新立克次氏体属(Neorickettsia)、东方体属(Orientia)和衣原体属(Chlamydia)的立克次氏体(Rickettsiale)和衣原体(Chlamydiale)进行靶向诱变的系统仍然是理解微生物致病机理和确定许多细菌基因的功能重要性的主要障碍。衣原体目和立克次氏体目已经经历了最大程度的(extreme)基因组减少，其中大多数基因对于每种病原体的细胞内生长可能至关重要。因此，专性细胞内细菌依赖它们的宿主来填补由于基因组减少而引起的缺陷。与该假设相一致，先前的研究表明，埃立克体属、无形体属、立克次氏体属、新立克次氏体属、东方体属和衣原体属中74-92％的预测的基因于细菌在脊椎动物的宿主细胞和载体中复制期间是有转录活性的。产生靶向突变的挑战可能归因于被选择用于诱变的基因的基本性质、细胞内复制依赖性以及缺乏支持细胞外生长的方法。尽管使用转座子诱变成功地产生了随机突变，但是对于专性菌，在感兴趣的特定基因中产生靶向突变并随后进行互补是有问题的，并且也是专心追求的目标。

发明简述

本公开通过提供立克次氏体目和衣原体目的等位基因交换产生至少一种稳定的靶向的突变的方法填补了该主要空白。有利地，本公开还提供了破坏或失活多个基因并随后通过另一等位基因交换突变恢复至少一个完整基因的能力，导致失活基因从其自身的启动子的转录恢复。在优选的形式中，被破坏或失活的基因阻止或至少降低细菌在其专性宿主中复制的能力，同时仍诱导对该细菌特异的免疫应答。因此，本公开提供了细菌的减毒形式，其可用于诱导免疫反应的免疫原性组合物中，所述免疫原性组合物在预防性施用时降低与立克次氏体目和衣原体目相关的或由其引起的至少一种临床症状的发生率或严重性，并在感染已经发生后施用时，减少与立克次氏体目和衣原体目相关或由其引起的至少一种临床症状的持续时间或严重性。