[发明专利]用于产生周期性光图案的光学部件

说明书

用于用周期性光图案照射样品区域(955)的光学部件(910)，包括：第一波导(914)、另一波导(916、917、918、919)和光学分路器(913a)。光学分路器(913a)具有用于接收光的输入(911)、第一输出和第二输出。第一波导(914)被光学联接到第一输出，以在第一方向(914a)上将第一输入光引导到样品区域(955)中。第二输出被光学联接到样品区域(955)，以在第二方向(915a)上将第二输入光引导到样品区域(955)中。另一波导(916、917、918、919)被布置成接收第三输入光，该第三输入光在第三方向(916a、917a、918a、919a)上被引导到样品区域中。第一方向(914a)、第二方向(915a)和第三方向(916a、917a、918a、919a)彼此不同。第一输入光和第二输入光干涉以在样品区域(955)中形成周期性图案。所述光学部件(910)可以用于结构化照明显微镜。

技术领域

本发明涉及用于用周期性光图案照射样品的光学部件、系统和方法。更具体地，但非排他性地，本发明涉及使用结构化照明显微镜(SIM)对样品成像的光学部件、系统和方法。

背景技术

光学显微镜用于组织学、细胞生物学和相关领域中，以查看生物样品，诸如细胞。然而，由于光的衍射极限，光学显微镜的分辨能力受到限制。该限制将可见光显微镜的分辨率限制在200至300nm左右。为了克服该限制，在本领域中已经开发了几种技术，称为“纳米显微镜”、“超分辨率成像”或“超分辨率显微镜”。

这些超分辨率成像技术允许以比200nm更精细并且可能低至约20至50nm的分辨率对生物样品成像。它们通常处理从标记(诸如可光切换的荧光团或量子点)发射的光，这些标记已附着到生物样品或嵌入生物样品中。这种超分辨率技术的已知示例包括集合技术(诸如结构化照明显微镜(SIM)和受激发射损耗显微镜(STED))以及单分子定位技术(诸如光激活定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM))。

单分子定位技术通常提供更好的分辨率(例如20-50nm)，但通常比集合技术慢，并且因此通常不适合对活细胞样品成像。

通常，STED具有约30nm的实用光学分辨率。然而，因为它是基于扫描的技术(例如，基于栅格扫描的技术)，所以它也遭受不太适合活细胞成像的慢成像速度(对于宽视场为约0.1Hz)。当需要宽视场时(即，需要扫描大样品区域时)，该问题会更加严重。此外，STED技术通常需要大功率照射来激发发光标记(例如，荧光团)，并且这是有问题的，因为它可能导致光致漂白效应和光毒性。

在基于SIM的技术中，用不同的周期性光图案照射样品。通常，周期性光图案是使用衍射光栅产生的周期性条纹光图案。在成像处理期间，通常在一系列帧上，周期性光图案的条纹相对于样品发生偏移，并且也相对于样品旋转，从而产生并照射具有多个不同周期性光图案的样品。然后可以基于对来自由不同照射图案产生的发光标记的不同发射图案的傅立叶分析，来构造样品的超分辨率图像。由于周期性照射图案引起的莫尔效应，这些发射图案揭示了超出成像系统的分辨率极限的有关样品结构的信息。

常规的SIM设置通常具有约100-130nm的光学分辨率，并且比STED和单分子定位设置更快地获取图像(例如，对于宽视场而言，典型的SIM成像速度约为0.1-1Hz)。此外，与基于扫描的设置不同，常规的基于SIM的设置可以单次捕获样品的宽视场图像(例如50-100μm²或更大)。然而，对于许多实际的活细胞实验，通常仍认为常规基于SIM的设置(尽管分辨率低于STED)所提供的成像速度的改善不够快。

为了增加SIM设置的成像速度，可以减小拍摄图像的视场。使用这种方法，基于SIM的设置在8μm×8μm的视场中以11Hz的速度拍摄图像。然而，减小视场通常是不期望的，因为如果需要宽视场，则样品和成像装置然后需要相对于彼此重新定位和重新对准以获得整个样品的合成图像。这在对活细胞样品成像时尤其成问题。