[发明专利]低温保存方法

说明书

人类胆管树肝细胞/祖细胞（hBTSC）正被用于患有肝脏硬化的患者的细胞治疗。建立了低温保存方法以对用于这些临床项目的hBTSC的来源进行优化，并且其包含补充有10%二甲基亚砜（DMSO）、~3%重组人类白蛋白和0.1%透明质酸的无血清的Kubota培养基（KM）。在自我复制、干细胞特性和多能性方面，低温保存的hBTSC与新鲜分离的hBTSC相比在体外是相似的。它们能够分化成功能化的肝细胞、胆管细胞或胰岛细胞，产生相似分泌水平的白蛋白或葡萄糖诱导水平的胰岛素。与新鲜分离的hBTSC相比，低温保存的hBTSC同等地能够移植到免疫功能不全的小鼠中，产生具有人类特异性基因表达的细胞和小鼠血清中的人类白蛋白水平，低温保存的hBTSC的人类白蛋白水平高于新鲜分离的hBTSC。成功的hBTSC的低温保存促进了hBTSC细胞库的建立，为用于肝脏疾病治疗的临床项目提供了后勤优势。

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.119(e)，本申请要求2017年04月06日提交的美国专利申请号62/482,644的优先权，其整体通过引用方式并入本文。

背景技术

本发明通常涉及用于细胞的低温保存方法的领域。

在先前的工作中，申请人已经证明了在肝外胆管的(外周)胆道腺中存在表达一系列的内胚层标记物的细胞^[1-4]。人类组织中的这些原位的观察结果已经通过体外试验进行了补充，该体外试验证明了分离自胆管上皮的干细胞的亚群体(SOX9+/Pdx1+/Sox17+/EpCAM+、SOX9+/PDX1+/SOX17+/EpCAM-)具有长期(体外)维持和自我更新，并且能够产生更受限的成熟肝脏和胰脏不同谱系的子代^[1-4]。这些细胞(被称为人类胆管树干细胞/祖细胞，hBTSC)的发现开启了在不同问题中有相关影响的新场景，这些问题包括肝脏的胚胎学、胆管上皮和胰腺、胆管树的病理生理学、肝胆和胰腺的癌变、以及最后肝脏和胰腺的再生医学^[1-4]。在这方面，最近证明了胆囊的隐窝之内发现的hBTSC的配对物(推定为hBTSC的子代，称为人类胆囊干细胞/祖细胞(hGSC)^[5])增加了这些具有多潜能和分化能力的内胚层干细胞/祖细胞(hBTSC和hGSC)的群体用于肝脏疾病的细胞治疗的临床应用的可能性。重要的是，这些细胞是轻易地可分离且可培养的，并且免疫原性和致癌性潜能较低或为零^[6]。考虑到在为再生医学寻找细胞来源中的各种障碍^[7]，胆管树可代表用于再生医学的干细胞和祖细胞的理想来源。事实上，申请人成功将新鲜分离的hBTSC移植到肝硬化患者中，并在改善肝脏功能方面具有益处。

人类组织是难以获得的，并且当前对于临床项目的要求是新鲜分离细胞，这阻碍了为用于患者的治疗的细胞寻找来源。出于该原因，低温保存代表了在细胞治疗的临床项目中对于细胞产品的常规使用的强制性步骤。已经提出了大量不同的低温保存技术，包括低温保存试剂的使用^[8,9]、细胞包被技术^[10-12]、预处理技术^[13]和逐步冷冻^[14,15]。不幸的是，关于分离自实体器官的细胞类型(例如肝细胞)，已经报道了在解冻(thawing)之后在细胞活力和移植效率方面上的大的可变性^[13,16,17]。例如，Terry等人^[18]提出了使用纯化的人类血清白蛋白作为血清的替代物，以保存高的活力且获得定义的低温保存条件。最近，Turner等人^[19]开发了在人类肝脏干细胞(hHpSC)的低温保存期间通过使用补充有透明质酸(HA)的两种无血清的、完全定义的缓冲液中的任一种来保存粘附分子的表达的有效策略，该缓冲液为Crystor-10(CS10；Biolife Solutions,Bothell,WA,USA)或Kubota培养基(PhoenixSongs Biologicals,Branford,CT)。

发明内容