[发明专利]减少酵母中乙酸产生的选择的乙酰辅酶A合酶

说明书

描述了由于表达选择的异源乙酰辅酶合酶(ACS)而具有减少的乙酸产生的酵母。此类酵母可以进一步被修饰以减少甘油和/或增加乙醇产生。所述酵母可用于从含碳水化合物的底物生产乙醇。

技术领域

本发明的组合物和方法涉及由于表达选择的乙酰辅酶合酶(ACS)而具有减少的乙酸产生的酵母。此类酵母还可以被修饰以减少甘油和/或增加乙醇产生。所述酵母可用于从含碳水化合物的底物生产乙醇。

背景技术

基于酵母的乙醇生产是基于糖向乙醇的转化。当前通过此方法实现的年燃料乙醇产量在世界范围内为约900亿升。据估计，乙醇生产成本的约70％是原料。因为乙醇生产量如此之大，所以甚至小的产率提升对于该产业也具有巨大的经济影响。一摩尔葡萄糖转化为两摩尔乙醇和两摩尔二氧化碳的转化是氧化还原中性的，其最大理论产率为约51％。当前的工业产率为约45％；因此，存在增加乙醇产生的机会。

二氧化碳、甘油和酵母生物质是乙醇发酵的主要副产物。在酵母生长和发酵期间，生成过剩的NADH，其用于产生甘油以用于氧化还原平衡和渗透保护的目的。甘油被认为是低价值产品，并且已采用若干种方法来减少甘油产生。

先前已经描述了具有异源磷酸转酮酶途径的工程化酵母细胞(例如，WO2015148272)。这些细胞表达异源磷酸转酮酶(PKL；EC 4.1.2.9)和磷酸转乙酰酶(PTA；EC2.3.1.8)，任选地具有其他酶，以使碳通量远离甘油途径导向，并且朝向乙酰辅酶A的合成导向，所述乙酰辅酶A然后转化为乙醇。与在其他方面相同的亲本酵母细胞相比，这些细胞能够在发酵过程中增加乙醇生产。不幸的是，这种修饰也产生增加的乙酸。

乙酸对包括酵母在内的大多数微生物均具有毒性。野生型酵母仅产生少量的乙酸(例如，在含有60g/l葡萄糖的培养基中产生100-300mg/l乙酸)。表达PKL的酵母中的乙酸产量大大提高(例如在同一培养基中为1-2g/l)。在工业谷物乙醇生产的条件下(其中发酵的葡萄糖的总量达到300g/l)，推算表达PKL的酵母菌株的乙酸产生可为5-10g/l。实际上，因为细胞由于乙酸中毒而停止生长，未观察到这样的浓度。

若干个研究人员试图过表达乙酰辅酶合酶(ACS)以减少表达PKL的酵母中乙酸的积累。例如，面包酵母含有两种ACS同工酶(ACS1和ACS2)。ACS1受严格的翻译后控制，在葡萄糖存在下会经受分解代谢物失活(De Jong-Gubbels,P.等人(1997)FEMS MicrobiologyLetters[FEMS微生物学快报]153:75-81)，而ACS2的乙酸的Km比ACS1的高约30倍(van denBerg等人(1996)J.Biol.Chem[生物化学杂志].271:28953-59)。在专门针对减少酵母中乙酸产生的研究中，de Jong-Gubbels等人得出的结论是，两种天然酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ACS的任何一种过表达均不能降低酵母培养基中的乙酸水平((1998)FEMSMicrobiology Letters[FEMS微生物学快报]165:15-20)。在后来的应用研究中，尝试使用天然ACSI酶或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella.typimurium)ACS的突变体(L614P)(据报道其能抵抗分解代谢物失活)。尽管鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的酶完成的比ACSI好，但乙酸的减少仅适中。

除了由某些酵母产生之外，一些用于生产乙醇的原料天然含有乙酸，这对酵母具有同样的不利影响。因此，出于各种原因，需要改变酵母代谢途径来最大化乙醇产生，同时不增加不期望的途径副产物(如乙酸)的产生。

发明内容

本发明的组合物和方法涉及由于表达选择的乙酰辅酶合酶(ACS)而表现出减少的乙酸产生的酵母。所述组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。

1.在一个方面，提供了经修饰的酵母细胞，所述酵母细胞包含：