[发明专利]重组蛋白及其片段、生产所述重组蛋白的方法、合成基因以及重组蛋白的用途

说明书

本发明属于生物化学、分子生物学、遗传学、药学和药物化学领域，与生物化学和代谢过程有关。更具体地，本发明提供了在蜱的唾液腺的转录组学分析中鉴定出的抑制凝血酶的一类新型蛋白，具体地是来自sculptin的修饰的直接的凝血酶抑制剂，以及其片段和重组蛋白，其可以用作抗凝剂和用于预防和/或治疗血栓栓塞性疾病。

技术领域

本发明描述了一种新型的凝血酶抑制剂蛋白，特别是凝血酶的直接抑制剂，以及其可以用作抗凝血剂的片段和重组蛋白。本发明属于生物化学、分子生物学、遗传学、药学、药物化学领域，与生物化学和代谢过程有关。

背景技术

凝血酶是在凝血级联反应中具有主要功能的多功能酶。其功能调节会导致正常的血液凝固或病症，如血栓形成。因此，识别新的强且特异性的凝血酶抑制剂非常重要。

血液凝固是一个动态过程，其涉及酶原级联反应，导致酶的下游激活。在正常情况下，它会导致体内平衡。血栓出血平衡在体内通过复杂而有争议的机制而被保持是至关重要的。然而，其失调可能导致出血或血栓形成。凝血酶是一种37kDa的异质二聚体，是凝血级联反应中的核心酶。凝血酶是一种多功能酶，通过纤维蛋白原裂解作用作为促凝剂，激活凝血因子类(V、VIII、XI和XIII)并诱导血小板凝集。另一方面，凝血酶可以通过血栓调节蛋白的结合作为抗凝剂并激活蛋白C。此外，它在动脉和静脉血栓形成、弥散性血管内凝血(DIC)、癌症、炎性脑病、伤口愈合和动脉粥样硬化中起着至关重要的作用。为了克服其有害作用，可以通过阻断凝血酶的三个结构域(即活性位点和外部位点1 和2)中的一个或两个直接或间接抑制该凝血酶。传统上，未分级肝素 (UFH)和低分子量肝素(LMWH)已被用作抗凝血剂，其通过同时与抗凝血酶和凝血酶的外部位点2连接来间接抑制凝血酶。但是，肝素(UFH和LMWH)会产生血纤蛋白-凝血酶桥并增加血栓形成，并可能引起肝素诱导的血小板减少。直接凝血酶抑制剂(DTI)是不需要辅助因子的一组抗凝剂，它们直接与凝血酶的活性位点结合并阻断其活性。 DTI比间接抑制剂具有优势，因为DTI是更加可预测的抗凝剂，因为它们没有抗血小板的作用，并且它们不会导致免疫介导的血小板减少。包括重组水蛭素(hirudin)及其水蛭肽(hirulog)的几种DTI被批准为用作抗凝剂。水蛭素是一种65个氨基酸的多肽(7kDa)，是一种直接的凝血酶抑制剂，首先是从药用水蛭(Hirudo medicinalis)的唾液中分离出来的。接下来，产生了重组水蛭素形式，由于没有被硫酸化的Tyr残基，其不同于天然水蛭素。这种差异稍微降低了重组水蛭素的活性。但是，重组水蛭素对凝血酶的抑制是不可逆的，并会产生抗水蛭素抗体，从而导致药物累积。当前，没有用于逆转重组水蛭素后果的解毒剂。此外，还开发了几种合成的水蛭肽并对其凝血酶的抑制剂活性进行了测试，但这些抑制剂的活性几乎是重组水蛭素的1/800。在所有水蛭肽中，比伐卢定(bivalirudin)是一种FDA批准的抗凝剂，是直接的凝血酶抑制剂，但半衰期短。几乎所有此类抗凝剂都涉及副作用，例如水蛭素- 凝血酶复合物的不可逆形成，水蛭肽的半衰期短，应密切监测其剂量。大多数此类凝血酶抑制剂来自蛭类，并且已被广泛研究。另一方面，来自蜱的凝血酶特异性抑制剂被完全遗忘，尽管已经对Kunitz型抑制剂进行了详细研究。

由于这些事实，令人感兴趣的是开发可以用作抗凝血剂的一类新型直接的凝血酶抑制剂及其片段和重组蛋白。

在科学和专利文献中的现有技术的检索中，发现了以下接近该主题的文件：

1.Posma,J.J.N.,Posthuma,J.J.&Spronk,H.M.H.Coagulation and non-coagulation effects of thrombin.J.Thromb.Haemost.14,1908–1916 (2016).

2.Lee,C.J.&Ansell,J.AND.Direct thrombin inhibitors:Parenteral andoral inhibitors of thrombin activity.Br.J.Clin.Pharmacol.72,581–592 (2011).