[发明专利]用于产生和筛选隔离的肽文库的方法

说明书

共同隔离环状多肽和编码所述环状多肽的多核苷酸的方法，包括以下步骤：a)形成包含编码所述环状多肽的多核苷酸的隔室，b)从所述多核苷酸表达多肽，以及c)使所述多肽环化。共隔室的环状多肽和编码多核苷酸。共隔室的环状多肽和编码多核苷酸的文库。用于筛选共隔室的环状多肽和编码多核苷酸的文库的方法。向这样的文库中掺入非经典的核酸。

技术领域

本发明涉及环状肽及其编码多核苷酸的共同隔离。特别地，本发明涉及这样的隔离的环状肽的文库，以及从这样的文库筛选、选择和分选隔离的环状肽的方法。

发明背景

在分散于油相中的水滴中隔离单个样品是一种用于化学和生物学中的高通量测定的强有力的方法。这里，液滴相当于试管。液滴包含评估和解码文库成员的特定实验或特性所需的一切东西。利用大多数乳化技术生产的液滴的尺寸不均匀，并且在需要定量读数的实验中出现错杂性。微流体装置允许产生高度单分散的水滴，其频率高达每秒几(10)千。它们的直径通常为10-200微米，对应于0.5pL-4nL的体积。除了液滴形成之外，微流体形式还允许许多其他单元操作，如液滴分裂、融合、孵育、分析和分选。

液滴微流体涉及纳升至飞升大小的水包油液滴的形成，其提供了特别适合隔离单个基因、生物体和细胞的明确界定且离散的环境。特别地，小型化提供了许多优势，包括减少样品消耗、提高分析性能、快速内容物混合和层流(流线型)流动。

水滴将基因型与表型关联起来，因为它们提供的隔离模仿了自然细胞的隔离。在每个人造隔室中，单个基因通过无细胞方式转录和翻译，以产生其编码的蛋白质的多个拷贝。这种体外隔离(IVC)产生了“单克隆单元”，其非常适合高通量文库选择和新型肽基生物制剂的鉴定。由于基因型和表型之间的联系并非化学关联，而是共同隔离的，因此可以选择多种功能(酶促、调节、抑制、结合和结构)。这优于现有的展示选择策略(例如，细菌、病毒、酵母和噬菌体展示)，其中选择仅基于结合相互作用。由于结合与抑制或催化无关，因此使用这样的策略可能无意中导致选择出与酶表面紧密结合但在其活性位点之外的较差的抑制剂。

涉及乳化的油包水(w/o)液滴中的体外蛋白质表达的研究通常使用绿色荧光蛋白(GFP)作为概念验证。Dittrich等人首次证明了用于无细胞蛋白质合成隔离和GFP表达的微结构化装置的实现。Courtois等人随后描述了用于含有可测量量的体外表达的GFP的液滴的存储和在线检测的集成芯片系统的实用性。然而，在一些情况下，仅分离单一模板不会产生足够的蛋白质以达到检测阈值。与单一lacZ基因一样，尽管β-半乳糖苷酶具有高的酶促活性(k_cat＝187s^-1，K_M＝150μM)，但仍无法检测到表达。这一问题可以通过DNA与等温扩增系统的共同封装来克服。利用Φ29DNA聚合酶进行芯片上等温扩增是产生μg量的双链DNA的一种简单的方法。该预扩增步骤包括含有液滴的IVTT与封闭扩增DNA的那些的协同融合，然而在许多情况下，DNA扩增、IVTT和任何后续酶促测定所需的最佳条件是不同的；例如，成功扩增DNA所需的组分可能会抑制IVTT。同样，可能需要在不同的pH值下或在不同的缓冲组合物中运行每个过程。

当使用油包水液滴时，不同生化反应彼此的相容性是一个问题。大多数生化方案是多步骤的过程：添加溶液，离心样品，除去上清液，洗涤团块等。将这样的方案转移到液滴是困难的。尽管可以利用专门的微流体装置来进行用于添加和/或稀释组分的液滴-液滴融合，但是当涉及较大的液滴数量并且需要额外的步骤(例如洗涤、缓冲液交换、添加或除去试剂)时，其实际上是具有挑战性的。此外，尽管液滴融合对液滴隔室的受控凝聚和化学及生物反应的启动至关重要，但该过程本身具有挑战性，因为例如液滴必须实现时间和空间同步以使融合发生，必须克服所利用的表面活性剂的稳定作用，并且对于活性融合需要使用专门的设备如电极，其中将液滴呈递至电场诱导它们的凝聚(电融合)。这使得液滴融合难以或不可能在连续的工作流中实施。

在体外进行多步骤的隔离反应的一种可选技术是使用于微流体液滴中的胶珠。这些技术对于生化过程特别有用，如高通量筛选、定向演化和基因分型方法。