[发明专利]用于基因组工程的与核酸内切酶相连的修复模板

权利要求书

1.一种人工分子复合物，包括

(a)至少一个位点特异性核酸酶(SSN)或其催化活性片段，或编码其的核酸序列，并且直接与(b)相互作用

(b)至少一个修复模板对接结构域(RTDD)或编码其的核酸序列，其中所述修复模板对接结构域被配置为直接与至少一个修复模板核酸序列(RT)相互作用；

(c)任选地包含至少一个相互作用结构域(IA)或编码其的核酸序列，其中所述至少一个相互作用结构域与所述至少一个位点特异性核酸酶或其催化活性片段直接相互作用，并且其中所述至少一个相互作用结构域被配置为提供选自由以下组成的组的至少一种功能：

(i)与所述至少一个修复模板对接结合域相互作用；和/或

(ii)与所述至少一个修复模板核酸序列相互作用；和/或

(iii)与基因组DNA序列特异性相互作用；

其中所述至少一个修复模板核酸序列包含至少一个与至少一个基因组互补序列互补的部分，并且其中所述至少一个修复模板核酸序列配置成介导DNA靶序列的修复。

2.根据权利要求1的人工分子复合物，其中所述位点特异性核酸酶或编码其的核酸序列选自以下至少一种：CRISPR核酸酶，包括Cas或Cpf1核酸酶；TALEN；ZFN；大范围核酸酶；限制性核酸内切酶，包括FokI或其变体；或两种位点特异性切口核酸内切酶；或其变体或催化活性片段。

3.根据权利要求1或2中任一项的人工分子复合物，其中所述至少一个修复模板对接结构域或编码其的核酸序列选自以下至少一个：生物素；适体；DNA、RNA或蛋白质染料，包括荧光团，包含荧光素，或其变体，马来酰亚胺或四氮唑(XTT)；特异性配置为与至少一个修复模板核酸序列相互作用的向导核酸序列；链霉抗生物素蛋白或其变体，优选单体抗生物素蛋白；抗生物素蛋白或其变体；亲和标签，优选链霉抗生物素蛋白标签；抗体；单链可变片段(scFv)；单域抗体(纳米抗体)；抗运载蛋白；农杆菌VirD2蛋白或其结构域；小核糖核酸病毒VPg；拓扑异构酶或其结构域；PhiX174噬菌体A蛋白；PhiX A*蛋白；VirE2蛋白或其结构域；或地高辛。

4.根据前述权利要求中任一项的人工分子复合物，其中所述至少一个相互作用结构域或编码其的核酸序列选自以下至少一种：DNA结合结构域；链霉抗生物素蛋白或其变体，优选单体链霉抗生物素蛋白；抗生物素蛋白或其变体；亲和标签；生物素化信号；生物素受体位点；链霉抗生物素蛋白标签；抗体；单链可变片段(scFv)；单结构域抗体(纳米抗体)；抗运载蛋白；生物素；适体；DNA、RNA或蛋白质染料，包括荧光团，包含荧光素，或其变体，马来酰亚胺或四氮唑(XTT))；特异性配置为与所述至少一个修复模板核酸序列相互作用的向导核酸序列；农杆菌VirD2蛋白或其结构域；小核糖核酸病毒VPg；拓扑异构酶或其结构域；PhiX174噬菌体A蛋白；PhiX A*蛋白；VirE2蛋白或其结构域；或地高辛。

5.根据前述权利要求中任一项的人工分子复合物，其中所述至少一个位点特异性核酸酶和/或所述至少一个修复模板核酸序列和/或所述至少一个相互作用结构域包含至少一个核定位序列、质体定位序列，优选线粒体定位序列或叶绿体定位序列。

6.根据前述权利要求中任一项的人工分子复合物，其中所述至少一个修复模板核酸序列包含至少一个末端部分，优选3'末端，其中该末端部分不与所述人工分子复合物的任何其他组分相互作用，并因此配置成与至少一个基因组互补序列杂交以介导所述DNA靶序列的修复，和/或其中所述至少一个修复模板核酸序列作为质粒提供。

7.根据前述权利要求中任一项的人工分子复合物，其中所述至少一个位点特异性核酸酶或其催化活性片段或编码其的序列选自CRISPR核酸酶，优选选自Cas或Cpf1核酸酶，或FokI核酸酶，或其催化片段，且所述至少一个相互作用结构域或编码其的序列选自单链可变片段或单体链霉抗生物素蛋白。