[发明专利]分离新抗原-特异性T细胞受体序列的方法

说明书

公开了分离配对的T细胞受体(TCR)α和β链序列或其抗原结合部分的方法。还公开了自动鉴定TCR的TCRα和β链V区段序列和CDR3序列的方法，所述TCR对由癌症特异性突变编码的经突变的氨基酸序列具有抗原特异性。还公开了制备表达配对的TCRα和β链序列或其抗原结合部分的细胞群的方法。还公开了通过所述方法制备的经分离的TCRα和β链序列对和经分离的细胞群。

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2017年3月31日提交的美国临时专利申请第62/479,398号的权益，其通过引用并入。

关于联邦资助的研究和开发的声明

本发明是在美国国立卫生研究院，美国国立癌症研究所授予的项目号ZIABC010985的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

通过引用并入以电子方式提交的材料

通过引用整体并入本文的是计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，其与本文同时提交并标识如下：一个名为“737921SeqListing_ST25.txt”的5,530字节的ASCII(文本)文件，日期为2018年3月22日。

发明背景

使用已经遗传工程化以表达癌症抗原(如，新抗原(neoantigen))-特异性T细胞受体(TCR)的细胞的过继性细胞疗法(ACT)可以在一些癌症患者中产生阳性临床响应。然而，成功使用TCR-工程化的细胞来广泛治疗癌症和其他疾病的障碍仍然存在。例如，特异性识别癌症抗原(如，新抗原)的TCR可能难以鉴定和/或从患者分离。因此，需要改进的获得癌症-反应性(如，新抗原-反应性)TCR的方法。

发明简述

本发明的实施方案提供了分离配对的T细胞受体(TCR)α和β链序列或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：(a)从生物样品分离对由癌症特异性突变编码的经突变的氨基酸序列具有抗原特异性的T细胞；(b)与呈递经突变的氨基酸序列的抗原呈递细胞(APC)一起共培养经分离的T细胞，使得所述T表达一种或多种T细胞活化标志物；(c)将共培养的T细胞分选成单独的单T细胞样品；(d)从每个单独的单T细胞样品分离mRNA；(e)对来自每个单独的单T细胞样品的mRNA进行测序，其中测序包括：(i)从所述mRNA产生cDNA并扩增所述cDNA；(ii)产生经扩增的cDNA的多个片段和标记所述多个片段；(iii)扩增所述cDNA的经标记的多个片段；和(iv)对所述cDNA的经扩增的经标记的多个片段进行测序；其中所述测序鉴定所述cDNA的多个片段中的每一个的序列；(f)将所述cDNA的多个片段中的每一个的序列与一种或多种T细胞活化标志物的已知序列比对，以鉴定哪个单T细胞样品含有表达一种或多种T细胞活化标志物的单个T细胞；(g)将所述cDNA的多个片段中的每一个的序列与参考TCR序列数据库比对，以鉴定在(f)中鉴定以表达一种或多种T细胞活化标志物的每个单独的单T细胞样品的cDNA的多个片段的TCRα链可变(V)区段序列和TCRβ链V区段序列；(h)在含有(g)中鉴定的所述TCRα链V区段序列的所述cDNA的多个片段中和在含有(g)中鉴定的所述TCRβ链V区段序列的所述cDNA的多个片段中鉴定TCR互补决定区3(CDR3)序列；(i)对共用相同α链CDR3氨基酸序列的cDNA的多个片段的数目和共用相同β链CDR3氨基酸序列的cDNA的多个片段的数目进行计数；(j)收集编码相同α链CDR3序列的cDNA的最高数目的多个片段、编码相同β链CDR3序列的cDNA的最高数目的多个片段和任选地，编码相同α链CDR3序列的cDNA的第二高数目的多个片段，其中由cDNA的第二高数目的多个片段编码的α链CDR3序列不同于由cDNA的最高数目的多个片段编码的α链CDR3序列，以鉴定所述TCRα和β链CDR3序列；(k)鉴定(j)中收集的cDNA的最高数目的多个片段的TCRα链V区段序列、(j)中收集的cDNA的最高数目的多个片段的TCRβ链V区段序列和任选地，(j)中收集的cDNA的第二高数目的多个片段的TCRα链V区段序列，以鉴定所述TCRα和β链V区段序列；和(l)组装编码以下的一条或多条核苷酸序列：TCRα链，其包含(k)中鉴定的所述TCRα链V区段序列和(j)中收集的TCRα链CDR3序列，和TCRβ链，其包含(k)中鉴定的所述TCRβ链V区段序列和(j)中收集的TCRβ链CDR3序列，任选地组装编码以下的第二一条或多条核苷酸序列：第二TCRα链，其包含(k)中鉴定的cDNA的第二高数目的多个片段的TCRα链V区段序列和(j)中收集的cDNA的第二高数目的多个片段的TCRα链CDR3序列，和TCRβ链，其包含(k)中鉴定的TCRβ链V区段序列和(j)中收集的TCRβ链CDR3序列，以产生经分离的配对的TCRα和β链序列或其抗原结合部分。