[发明专利]用于保存组织和核酸的方法和组合物

说明书

本发明提供了用于在环境温度下保存含有核酸的组织样品而无需冷取样或冷储存的方法和组合物，所述核酸包括DNA。储存后，然后可以通过已知的方法例如PCR对所述样品中的所述保存的DNA进行处理和分析。在一个方面，本发明提供了一种简单快速地储存和/或处理来自各种来源的核酸诸如DNA的方法，所述各种来源包括但不限于植物、组织、含有质粒的细菌细胞裂解物等。本发明进一步包括在碱性pH下使用甘油处理生物样品并使DNA可用于PCR而无需进行进一步样品纯化的试剂和方法。因此，在一个方面，本发明提供了一种简单快速地处理来自各种来源的核酸诸如DNA的方法，所述各种来源包括但不限于植物、组织、含有质粒的细菌细胞裂解物等。

技术领域

本发明披露的主题涉及用于保存和制备含有核酸的组织样品的方法、组合物和试剂盒。本发明总体上涉及能够简单有效地保存和处理大量生物样品的试剂和方法。更具体地讲，本发明涉及用于储存和/或处理直接用于PCR和其他DNA应用的生物样品的试剂和方法。本发明进一步提供了处理生物样品和使DNA可用于PCR而无需进一步 DNA纯化的试剂和方法。本发明披露的主题还可用于低通量且快速的护理点诊断应用。

背景技术

分子诊断中的聚合酶链式反应(PCR)使得需要开发能够简单有效地保存和处理大量生物样品的试剂和方法。

传统的碱裂解需要以下步骤：对在生长培养基中稀释的细胞进行浓缩或沉淀；离心或涡旋；用碱性洗涤剂裂解细胞；振荡和/或搅拌裂解物；添加中和缓冲液；过滤和/或操纵样品以除去絮状物质；添加固相载体；以及添加结合缓冲液。通常需要如下的另外的纯化步骤来除去洗涤剂和盐：添加固相载体以及添加结合缓冲液。

DNA诊断中常常用到的来源是血液，但是也经常使用口腔拭子和组织活检，特别是用于癌症检测。目前，对组织样品进行储存和冷冻保存、福尔马林固定或石蜡包埋。使用福尔马林固定或石蜡包埋的样品需要多步骤过程以使来自这些样品的DNA可用于PCR。用于DNA 诊断目的的血液储存需要冷藏、冷冻干燥或冷冻。替代性地，将血液样品施加到卡片诸如FTA卡(英杰公司(Invitrogen))上，并在室温下干燥储存。Leal-Klevez等人开发了一种在-20℃下在20％乙二醇 -丙二醇水溶液中储存血液和组织样品的方法。在该方案中，DNA可以通过蛋白酶K-苯酚提取程序从储存的样品中提取。

美国专利号6,602,718描述了用于使用pH范围约2至约12的补充有添加剂(包括离液盐)的阳离子洗涤剂的水溶液或分散体来稳定生物样品中的RNA和DNA的方法和试剂。

已经使用了各种样品处理方法来制备用于PCR分析的DNA。 DNA典型地使用基于苯酚的方法、盐-醇沉淀法或柱吸附法来提取。 Current Protocols[实验室指南]第2.0.1-2.4.5页中提供了对这些方法的综述。另外，美国专利号5,346,994和5,945,515描述了用于DNA分离的试剂和方法。这些试剂和方法提供基本上纯的DNA。然而，这些方法耗时且不易于适应自动化。已经开发了用于在不事先分离DNA的情况下对样品进行PCR的方法，例如：在94℃下加热样品(Mercier 等人)、微波辐射(Ohhara等人)和用嗜热蛋白酶处理(Belly等人)。这些方法中的许多依赖于40个循环的PCR扩增。40个循环的PCR 扩增易于产生伪影，并且不能可靠地用于诊断目的。

以前，将碱裂解用于制备直接用于PCR的血液和其他样品，而无需纯化DNA。Rudbeck等人使用0.2M的NaOH在室温下裂解全血、精液和上皮细胞。将裂解物中和并直接用于PCR。20mM的NaOH不能有效释放可用于PCR的DNA。Ashen等人通过首先分离血液白细胞(通过离心和裂解)修改了该方案。将分离的白细胞在室温下在0.2 M的NaOH中裂解。将裂解物中和并用于PCR。

Truett等人使用pH 12的25mM NaOH-0.2mM EDTA二钠缓冲液，通过在95℃下加热来裂解小鼠组织样品。加热后，将样品裂解物中和并用于PCR。该方法不是非常有效，因为它涉及40个循环的PCR 来扩增DNA片段。此外，碱裂解物的中和在方案中增加了一个步骤，并且对精确测定裂解物中的pH有严格的要求。