[发明专利]使用阻断性寡核苷酸进行选择性扩增

说明书

本文披露的内容包括用于选择性扩增和/或延伸样品中的核酸靶分子的方法和组合物。这些方法和组合物可以例如减少该样品中的不期望的核酸种类的扩增和/或延伸、和/或允许选择性除去该样品中的不期望的核酸种类。

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年2月1日提交的美国临时申请号62/453,163的优先权。该相关申请的内容通过引用以其全文明确地并入本文。

背景技术

不同基因的表达水平可能在生物样品中显著不同。例如，基因表达的一些大类是：1)由5-10个基因构成的占细胞mRNA约20％的“高表达子”；2)由50-200个基因构成的占细胞mRNA 40％-60％的“中间表达子”；以及3)由10,000-20,000个基因构成的占细胞mRNA其余部分的“中度表达子”。分子生物学和分子遗传学中的一项挑战是有效且准确地捕获这种高度动态的基因表达谱，以便区分样品中的不同细胞类型和表型。

近年来，下一代测序(NGS)在评估基因表达谱方面提供了高通量方法。在用于NGS的文库制备期间，通过PCR扩增具有异源cDNA种类的样品以获得足够的样品量并附接NGS相容性衔接子。该测序过程从PCR扩增的文库样品中捕获每个基因的读段数，以解释基因表达水平。然而，由于不同的基因在大范围的水平下表达，因此PCR扩增可能使天然基因表达偏斜。例如，具有1个cDNA分子的基因需要40个PCR循环才能获得与具有1000个cDNA分子的基因在30个循环中相同的代表量。在异质cDNA样品中，PCR通常以过量循环进行，从而充分扩增低表达子；在这些情形中，天然基因表达谱通常因占主导的高表达子PCR产物而偏斜。校正PCR产物中的这种偏差的方法是分子索引(Molecular Indexing)；然而，高表达子(诸如核糖体蛋白mRNA、线粒体mRNA或管家基因)通常支配测序运行，对实验解释几乎没有贡献。需要选择性地扩增感兴趣的序列。

发明内容

本文披露了一种选择性扩增的方法。在一些实施例中，该方法包括：提供包含多种核酸靶分子和一种或多种不期望的核酸种类的样品；提供多种寡核苷酸探针，其中该多种寡核苷酸探针中的每一种包含分子标记序列和结合区；使该多种寡核苷酸探针与该多种核酸靶分子接触以进行杂交；延伸与该多种核酸靶分子杂交的寡核苷酸探针以生成多种延伸产物；提供特异性结合该一种或多种不期望的核酸种类中的至少一种的阻断性寡核苷酸；以及扩增该多种延伸产物以生成多种扩增子，由此该阻断性寡核苷酸减少该不期望的核酸种类的扩增或延伸。本文还披露了一种选择性延伸的方法。在一些实施例中，该方法包括：提供包含多种核酸靶分子和一种或多种不期望的核酸种类的样品；提供多种寡核苷酸探针，其中该多种寡核苷酸探针中的每一种包含分子标记序列和结合区；使该多种寡核苷酸探针与该多种核酸靶分子接触以进行杂交；提供特异性结合该一种或多种不期望的核酸种类中的至少一种的阻断性寡核苷酸；以及延伸与该多种核酸靶分子杂交的寡核苷酸探针以生成多种延伸产物；由此该阻断性寡核苷酸减少该不期望的核酸种类的延伸。

在本文披露的方法和组合物中，该阻断性寡核苷酸可以是例如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、DNA、LNA/PNA嵌合体、LNA/DNA嵌合体、或PNA/DNA嵌合体。在一些实施例中，这些方法包括提供阻断性寡核苷酸，这些阻断性寡核苷酸特异性结合该样品中的两种或更多种不期望的核酸种类。在一些实施例中，这些方法包括提供阻断性寡核苷酸，这些阻断性寡核苷酸特异性结合该样品中的至少10种不期望的核酸种类。在一些实施例中，这些方法包括提供阻断性寡核苷酸，这些阻断性寡核苷酸特异性结合该样品中的至少100种不期望的核酸种类。

该阻断性寡核苷酸可以具有至少60℃的Tm、至少65℃的Tm、或至少70℃的Tm。在一些实施例中，该阻断性寡核苷酸不能用作逆转录酶或聚合酶的引物。在一些实施例中，该不期望的核酸种类的扩增或延伸减少至少50％。在一些实施例中，该不期望的核酸种类的扩增或延伸减少至少80％。在一些实施例中，该不期望的核酸种类的扩增或延伸减少至少90％。在一些实施例中，该不期望的核酸种类的扩增或延伸减少至少95％。在一些实施例中，该不期望的核酸种类的扩增或延伸减少至少99％。