[发明专利]组装和编辑用于多个宿主的多个DNA构建体的模块化通用质粒设计策略

权利要求书

1.一种重组模块化CRISPR DNA构建体，其包括CRISPR多克隆位点，所述多克隆位点包括：

a)至少两个不同克隆标签(cTAG)，其中每个cTAG包括：

i)一或多个经验证的CRISPR着陆位点，每个着陆位点包括可操作地连接到前间隔区邻近基序PAM的前间隔区序列；其中至少一个所述经验证的CRISPR着陆位点在所述模块化CRISPR DNA构建体内是独特的；和

b)一或多个DNA插入部分；

i)其中每个所述不同cTAG分布在所述一或多个DNA插入部分中的每一个周围的侧接位置。

2.根据权利要求1所述的模块化CRISPR DNA构建体，其中所述模块化CRISPR DNA构建体是环状的。

3.根据权利要求1所述的模块化CRISPR DNA构建体，其中所述模块化CRISPR DNA构建体是线性的。

4.根据权利要求1所述的模块化CRISPR DNA构建体，其中所述模块化CRISPR DNA构建体整合到生物体的基因组中。

5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的模块化CRISPR DNA构建体，其中至少一个所述不同cTAG包括至少两个经验证的CRISPR着陆位点。

6.根据权利要求5所述的模块化CRISPR DNA构建体，其中至少一个所述CRISPR着陆位点是针对Cas9内切核酸酶的。

7.根据权利要求6所述的模块化CRISPR DNA构建体，其中至少一个所述CRISPR着陆位点是针对Cpf1内切核酸酶的。

8.根据权利要求1所述的模块化CRISPR DNA构建体，其中至少一个所述不同cTAG包括稀有(≥8个碱基长)限制性内切核酸酶位点。

9.一种制备重组核酸分子的方法，所述方法包括：

a)培育混合物，所述混合物包括：

i)多个DNA插入部分，其中每个DNA插入部分侧接有两个克隆标签(cTAG)，每个cTAG包括：

1)一或多个经验证的CRISPR着陆位点，每个着陆位点包括可操作地连接到前间隔区邻近基序PAM的前间隔区序列；和

ii)一或多种CRISPR复合物，其靶向存在于所述多个DNA插入部分中的至少两个中的至少一个所述cTAG，每种CRISPR复合物包括：

1)CRISPR内切核酸酶，和

2)能够将所述CRISPR内切核酸酶募集到所述靶向cTAG中的一个的引导RNA；

所述培育是在允许所述多个DNA插入部分中的至少两个中的所述靶向cTAG消化的条件下进行，以生成消化DNA末端，和

b)将在(a)中生成的具有消化cTAG的所述DNA插入部分在允许所述消化DNA末端的共价连接的条件下培育；其中所得重组核酸分子包括在所述方法中接合的所述原始插入部分的完整cTAG序列。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述消化DNA末端是具有突出序列的粘性末端，所述突出序列能够在所述消化末端的共价连接之前彼此杂交。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述CRISPR内切核酸酶是Cpf1。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述消化DNA末端是钝末端。

13.根据权利要求12所述的方法，其中用ssDNA外切核酸酶进一步消化所述钝末端以产生具有突出序列的粘性末端，并且其中步骤b)进一步包括在所述消化末端的共价连接之前加入能够与所述突出序列杂交的桥接DNA序列。

14.根据权利要求9、12或13所述的方法，其中所述CRISPR内切核酸酶是Cas9。