[发明专利]制备多糖-蛋白缀合物的方法

说明书

本发明提供了制备多糖‑蛋白质缀合物的方法，其中在改善缀合反应一致性、增加缀合反应期间蛋白的消耗、产生更高分子量的缀合物和/或降低缀合反应产物中游离氰化物的含量的条件下，通常来自细菌的多糖通过还原胺化与载体蛋白缀合。使用这些方法获得的多糖‑蛋白缀合物可用于包含在多价疫苗中。

技术领域

本发明提供了在能够形成高分子量缀合物和/或使载体蛋白的消耗最大化的条件下通过还原胺化制备多糖-蛋白缀合物的方法。使用这些方法获得的多糖-蛋白缀合物可用于包含在多价疫苗中。

背景技术

来自细菌的荚膜多糖已经在疫苗中使用了多年，因为它们诱生能够中和细菌的、具有调理吞噬作用的抗体。然而，大多数多糖是T-非依赖性抗原，因此在婴儿和老年人中它们具有很差的免疫原性。多糖与载体蛋白的共价缀合可以将T-非依赖性抗原转化为T-依赖性抗原，从而增强记忆反应并允许在这些患者群体中形成保护性免疫。因此，用于婴儿的最有效的多糖疫苗是基于糖缀合物的。

已知多种方法用于将多糖缀合至载体蛋白。一些方法涉及在通过接头缀合之前随机活化多糖链(例如，用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP))(参见，例如，Watsonet al.(1992)Infect Immun.60(11):4679-86；和Konadu et al.(1996)Infect Immun.(7):2709-15)。用于将多糖与蛋白缀合的还原胺化方法公开于美国专利No 4,761,283和欧洲专利No.EP477 508和EP 562 107。

在任何一种所述的缀合化学反应中，缀合效率和一致性对于控制过程和产物是至关重要的。特别是，使用现有技术方法由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型3多糖制备的缀合物的免疫原性不太令人满意。参见，例如，Andrews et al.,2014,LancetInfect Dis；14:839–46。因此，仍然需要以提高的效率和一致性制备缀合物的进一步更好的方法。

发明内容

本发明提供了在能够形成高分子量缀合物和/或使载体蛋白的消耗最大化的条件下通过还原胺化制备多糖-蛋白缀合物的方法。使用这些方法获得的多糖-蛋白缀合物可用于包含在多价疫苗中。

在第一方面，本发明提供了一种生产多糖蛋白缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：a)在氰基硼氢化物盐和镍(II)的存在下，使活化的多糖与载体蛋白在水性缓冲液中反应；b)任选地，添加强还原剂；c)纯化缀合反应混合物以除去未反应的多糖、蛋白和缀合试剂。步骤a)可以在6.0-8.5的pH下或在6.5-7.5的pH下进行。镍可以是氯化镍(NiCl₂)或硫酸镍(NiSO₄)的形式。镍可以以0.5mM-15mM，或0.5mM-5mM的浓度存在。在某些实施方案中，在加入氰基硼氢化钠之前将镍加入至反应混合物中。在某些实施方案中，纯化步骤通过超滤进行。

本文所述的用于该方面的方法适用于多糖，包括但不限于脑膜炎球菌多糖、肺炎球菌多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、伤寒沙门氏菌(Salmonnella typhi)Vi多糖以及B族链球菌多糖。在本发明的某些实施方案中，多糖是肺炎链球菌荚膜多糖。

在该方面的某些实施方案中，缀合反应温度控制在10-30℃或10-22℃。

在第二方面，本发明提供了通过还原胺化制备肺炎链球菌血清型3多糖蛋白缀合物的方法，所述方法包括：a)使活化的血清型3多糖与载体蛋白在水性缓冲液中，在氰基硼氢化物盐的存在下，在2-25℃的温度以及7.0以下的pH下或在2-10℃的温度以及7.7以下的pH下，反应；b)任选地，添加强还原剂；c)纯化缀合反应混合物以除去包含游离氰离子的残余反应物。在某些实施方案中，纯化步骤通过超滤进行。

在该方面的某些实施方案中，步骤a)在6.0-7.0或6.2-6.9的pH下进行。在该方面的某些实施方案中，步骤a)中的反应温度为2-23℃，4-15℃或8-12℃。