[发明专利]制备经不对称标签化的测序文库的方法

权利要求书

1.一种制备经不对称标签化的测序文库的方法，所述方法包括：

(a)获得cDNA或基因组DNA片段的经对称标签化的文库，其中所述文库的至少一些成员包含含有5'序列标签和3'序列标签的顶链，其中所述5'和3'序列标签包含互补序列；

(b)使第一引物与所述文库的3'序列标签的区杂交，其中所述第一引物包含与所述文库的3'序列标签的所述区互补的3'区和5'非互补尾；

(c)延伸所述第一引物以产生引物延伸产物，所述引物延伸产物从5'至3'包含所述第一引物的序列、片段的序列和(a)的5'序列标签的互补序列；以及

(d)使用以下来扩增(c)的引物延伸产物：

i包含序列A4的正向引物；和

ii式A5-A2的反向引物，其中序列A5是5'尾，并且序列A2包含在(a)的5'序列标签中；

以产生经不对称标签化的文库，其中至少一些成员包含顶链，所述顶链包含i.包含序列A5的第一末端，ii.片段的序列，和iii.包含序列A4的互补序列的第二末端。

2.根据权利要求1的方法，其中(a)的5'和3'序列标签各自包含在所述文库中序列变化的双链分子条码。

3.根据权利要求2的方法，其中所述分子条码是随机序列。

4.根据权利要求1的方法，其中(b)的第一引物的5'尾包含序列变化的样品索引。

5.根据权利要求1的方法，其进一步包括：分析步骤(d)的产物。

6.根据权利要求5的方法，其中所述分析包括对步骤(d)的产物进行测序。

7.根据权利要求1的方法，其中所述方法包括在步骤(c)和(d)之间除去、灭活或破坏任何未延伸的第一引物。

8.根据权利要求1的方法，其中(a)的文库是通过标签化来制备。

9.根据权利要求1的方法，其中所述标签化是使用Tn5或Vibhar转座酶来完成。

10.根据权利要求1的方法，其中(a)的文库是通过将衔接子连接到cDNA或基因组片段的群体来制备。

11.根据权利要求10的方法，其中所述cDNA或基因组片段是通过物理、化学或酶促方法使初始cDNA或基因组样品片段化来制备。

12.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)的文库通过以下来制备：(i)制备包含cDNA或基因组DNA的片段的经初始标签化的文库，所述cDNA或基因组DNA的片段在两个末端包含序列标签，其中所述序列标签包含单链区，和(ii)延伸所述经初始标签化的文库的3'末端中的至少一些以使单链区成为双链。

13.根据权利要求12的方法，其中所述单链区含有单链分子条码，并且其中所述延伸将所述单链分子条码转化为双链分子条码。

14.根据权利要求13的方法，其中使用链置换聚合酶完成所述延伸。

15.根据权利要求13的方法，其中使用非链置换聚合酶完成所述延伸。

16.根据权利要求6的方法，其进一步确定同一分子上的两个或更多个分子条码的序列。

17.根据权利要求16的方法，其进一步包括：使用所述分子条码序列将来自双链体顶链的测序读段与来自互补链的测序读段相关联。

18.根据权利要求1的方法，其中在杂交步骤(b)期间添加另外的序列A2和与A3互补的序列。