[实用新型]一种微流控数字PCR检测芯片

说明书

本实用新型公开了一种微流控数字PCR检测芯片，其包括一个以上芯片主体，每个芯片主体包括PCR扩增液滴生成单元和PCR扩增荧光信号检测单元，所述PCR扩增液滴生成单元包括油相进样腔体、DNA样本进样腔体和PCR反应液腔体，所述油相进样腔体与PCR反应液腔体之间设置有第一流道，所述第一流道于PCR反应液腔体的出口处环绕设置，所述PCR扩增荧光信号检测单元包括液体检测腔体和油相收集区。本实用新型的微流控数字PCR检测芯片用于外周血游离DNA EGFR的检测，不依托配套于市面上的数字PCR平台，通过微流控芯片生成的微反应器达到了对外周血游离DNA的低频突变进行检测，极大提高了检测灵敏度。

技术领域

本实用新型涉及一种微流控数字PCR芯片，特别涉及一种检测外周血游离DNAEGFR基因突变的微流控数字PCR芯片，属于分子生物及微流体控制技术领域。

背景技术

EGFR，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR，ERBB1/HER1) 是属于HER家族的一种跨膜蛋白，由胞外的结合区、跨膜区及主要由酪氨酸激酶组成的胞内区组成。当EGF及其他生长因子与EGFR胞外区结合时，胞内的受体酪氨酸激酶就会被活化，继而启动细胞内信号传导通路，引起细胞的增殖、分化、迁移、黏附、抗凋亡和细胞转化等效应。

常用的EGFR-TKI包括吉非替尼和厄洛替尼，是目前NSCLC患者最有效的靶向药物。但EGFR-TKI并非对所有患者都有效。EGFR外显子18、19或21发生突变的患者，吉非替尼有效率可高达80％，而野生型患者基本无效。EGFR敏感突变是药物有效的前提。但部分EGFR-TKI初始治疗有效的患者后期会发生耐药，与EGFR外显子20突变密切相关。以NSCLC为例，EGFRE20突变发生率为1.6％，约占EGFR突变9％，50％的EGFR-TKI 耐药由EGFRE20的T790M点突变所致。

2010版的美国国家癌症综合网络(NCCN)癌症治疗指南中明确指出：EGFR突变，尤其是外显子19的缺失突变和外显子21的L858R突变，与肿瘤对TKIs如吉非替尼治疗敏感性有重要关系。因此EGFR的基因突变检测对于指导这些患者选择能否选用TKIs治疗具有重要意义。

目前临床上对EGFR突变检测主要采用Sanger测序和荧光定量PCR方法，这两种方法由于技术局限性仅限于对肿瘤组织样本和肿瘤组织切片等DNA含量较高的样本，而无法检测到血液中的游离DNA的突变情况，2017年，宾夕法尼亚大学Abramson癌症研究中心的研究人员在《Clinical Cancer Research》杂志上表明，对于晚期肺癌患者，非侵入性的液体活检技术在检测临床相关突变中更加有效，也是标准组织活检最合适的替代技术。

近年来快速发展起来的基于单分子扩增的数字化PCR(digital PCR，dPCR)是一项检测和定量核酸的新技术。数字化PCR在进行扩增反应前，将含有DNA模板的PCR溶液稀释后分布到大量的独立反应室，单分子间通过稀释分离，并且独自进行PCR扩增，最后仅通过计数反应室中扩增是否发生，即可达到核酸的绝对定量，而不靠任何校准物或外标。同时，这种样品的分配增加了扩增靶标的绝对浓度并降低本底信号的影响，因此能显著提高低丰度靶标的扩增灵敏度，降低错误的阴性检出水平(单DNA模板出现在反应室而未被检出)。目前，数字化PCR已被证明是一项具有可重复性的定量微量DNA分子的优良技术，其特异性强、灵敏度高、定量准确等优点将使其成为了分子生物学研究中的重要工具。数字化PCR经过从96孔板到基于微流控芯片的纳升小室，再到基于微流控芯片的皮升级液滴微反应器(Drop-based digital PCR,ddPCR)，经过了十几年的发展演变。目前，ddPCR以其显著提高的通量和灵敏度获得了越来越多的认可。

目前临床上传统的EGFR突变检测方法为杂交芯片、Sanger测序以及荧光定量PCR法，这些方法普遍存在的问题是，其灵敏度低无法检测外周血游离DNA的低频突变，这就要求更有灵敏的技术平台对低丰度的游离DNA突变进行检测。