[实用新型]一种对虾感染虾肝肠胞虫PCR检测试剂盒

说明书

本实用新型公开了一种对虾感染虾肝肠胞虫PCR检测试剂盒，检测试剂盒包括盒体、盒盖，支撑板架设有内装2×PCR buffer的PCR buffer管；内装虾肝肠胞虫正反引物的引物管，正向引物序列：5’‑ATT AGA CAC CGC TGT AGT TC‑3’，反向引物序列：5’‑GTT ATT GCC TTC TCC CTC T‑3’；内装无菌去离子水的去离子水管；内装SPF（无特定病原体）对虾核酸的阴性对照管；内装虾肝肠胞虫10⁶拷贝cDNA阳性克隆的阳性对照管，检测方法包括：(1)设计引物(2)PCR反应体系(3)PCR反应。本实用新型灵敏度高、特异性好，操作简单、快速。

技术领域

本实用新型涉及一种对虾感染虾肝肠胞虫PCR检测试剂盒，属于海洋生物病原检测技术领域。

背景技术

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)于2009 年在泰国养殖的生长缓慢的斑节对虾(Penaeus monodon)中首次报道，主要感染斑节对虾和凡纳滨对虾（Litopenaeus vannam ei），现已在泰国、越南、中国、印度尼西亚、马来西亚等国家广泛流行。EHP是一种胞内寄生虫，属于微孢子虫科、肠胞虫属，主要寄生于对虾肝胰脏中，导致对虾生长阻滞，给对虾养殖业造成巨大经济损失。

对虾感染EHP后并无明显外观症状，灵敏、特异、快速的检测方法是EHP早期预防的重要有效手段。PCR技术因其灵敏度高、特异性强、简便快速等特点，在对虾病原的检测和诊断方面得以广泛应用，建立EHP高灵敏度的PCR检测方法，以及配合该检测方法使用的检测试剂盒极为重要。

实用新型内容

本实用新型的目的在于解决现有PCR检测方法灵敏度不高的问题，提供对虾感染虾肝肠胞虫PCR检测试剂盒，同时还提供利用该试剂盒进行检测的检测方法，该检测方法灵敏度高、特异性好，操作简单、快速。

本实用新型的目的可以提供如下措施来达到：一种对虾感染虾肝肠胞虫PCR检测试剂盒，其包括盒体、设在盒体开口处的盒盖，盒体内设有支撑板架，支撑板架上设有PCRbuffer管孔、引物管孔、去离子水管孔、阴性对照管孔、阳性对照管孔，PCR buffer管孔处设有PCR buffer管，内装2×PCR buffer；引物管孔处设有引物管，内装虾肝肠胞虫正反引物，正向引物序列：5’- ATT AGA CAC CGC TGT AGT TC -3’；反向引物序列：5’- GTT ATT GCCTTC TCC CTC T -3’；去离子水管孔处设有去离子水管，内装无菌去离子水；阴性对照管孔处设有阴性对照管，内装SPF（无特定病原体）对虾核酸；阳性对照管孔处设有阳性对照管，内装虾肝肠胞虫10⁶拷贝cDNA阳性克隆。

为了进一步实现本实用新型的目的，所述的盒盖的后端与盒体的开口处转动连接，前端向下弯折形成连接部，所述连接部朝向盒体的内侧设有铁片，所述盒体的前端设有与铁片相对应的磁铁。

本实用新型同已有技术相比可产生如下积极效果：

本实用新型对虾感染虾肝肠胞虫PCR检测试剂盒，根据虾肝肠胞虫SSU rDNA（KF362129）基因序列重新设计特异性强、合成率高的引物，通过优化引物浓度、退火温度等反应条件，建立高灵敏度的对虾感染虾肝肠胞虫的荧光定量PCR检测方法。此试剂盒可应用于对虾健康苗种培育、养殖防病、虾病生态调查、虾苗放流等过程的虾肝肠胞虫检测，具有很高的推广应用价值。本实用新型检测方法灵敏、特异，操作简便，其具有： (1) 灵敏度高：可以检测到100拷贝的虾肝肠胞虫。 (2) 特异性好：与图3中其它2种常见对虾病原及对虾组织不发生交叉

反应。

(3) 操作简单、快速：PCR buffer中已包含反应所需的酶、dNTP、离子等，正反引物已按比例混匀，简化了操作步骤。