[发明专利]一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法

说明书

本发明提供了一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法。该方法采用少量多次加液方式，使小组织块也能达到优良的贴壁效果；使用自主研发的成纤维细胞选择性培养基，使成纤维原代细胞快速爬出生长，纯度在95％以上；发明人还提供了一种纯化成纤维细胞的培养方法，可以将成纤维细胞纯度提高到99％。本发明提供的方法可大大减小皮肤组织块提供者创伤面积，有效缩短成纤维原代细胞培养时间，对组织块伤害小，可以稳定进行多次成纤维细胞原代培养，操作简便。本发明不仅适用于人和小鼠等皮肤组织块成纤维原代细胞培养，也适用于脐带来源、胎盘来源干细胞、癌旁组织等原代细胞培养，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法。

背景技术

成纤维细胞是人真皮结缔组织中最常见的细胞，它可以合成胶原蛋白和弹性蛋白，构成皮肤组织的结构框架；可合成细胞外的纤维、基质和蛋白多糖，为新生的血管和增生的细胞提供支架；能促进软组织的强化作用和促进组织的再生作用；可以为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)细胞技术的研究提供种子细胞等。如何从皮肤组织中分离获得足够数量且具有很好活力的成纤维细胞是以上研究的关键步骤。

目前，皮肤成纤维细胞的分离培养方法主要有两类：酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法利用胰蛋白酶、胶原酶等对皮肤组织进行消化，去除组织表皮后，进行离心、重悬和培养，得到皮肤成纤维细胞；该方法可以把单个细胞从组织块中分离出来，在短时间内爬出纯度较高的成纤维细胞，但操作较为繁琐，对操作员要求较高，并且胶原酶对细胞存在不利影响，导致细胞的贴壁率低，活性不高。组织块法是将皮肤组织块直接接种于培养皿中进行培养，该方法操作简单，但组织块贴壁率较低，成纤维细胞爬出较慢，一般5～7天方有单细胞游出，20天以上才可进行传代，并且细胞纯度低。

本发明提供了一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法。该方法在常规组织块贴壁法的基础上，加以优化改良：采用少量多次加液方式，使小组织也能达到优良的贴壁效果；同时使用自主研发的成纤维细胞选择性培养基，使成纤维原代细胞快速爬出生长，且纯度在95％以上；在此基础上，发明人还提供了一种纯化成纤维细胞的培养方法，可将细胞纯度提高到99％。本发明提供的方法可大大减小皮肤组织块提供者创伤面积，有效缩短成纤维原代细胞培养时间，对组织块伤害小，可以稳定进行多次成纤维细胞原代培养，操作简便，实用性强，因此本发明在成纤维原代细胞培养及其应用等方面具有广阔的应用前景。本发明不仅适用于人和小鼠等皮肤组织块成纤维原代细胞培养，同时也适用于脐带来源干细胞、胎盘来源干细胞、癌旁组织等原代细胞培养。

发明内容

为了解决现有技术中存在的种种缺陷，本发明在常规组织块贴壁法的基础上，加以优化改良，旨在提供一种操作简单的皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，在保证细胞活率高的同时，有效提高贴壁率，缩短从皮肤组织获得稳定高纯度成纤维细胞所需要的原代培养时间。具体地，本发明提供了以下技术方案，以实现上述目的：

第一方面，本发明提供了一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，包括以下步骤：

步骤(1)：先用碘酒或酒精擦拭取皮区皮肤消毒，用活检取样器、手术刀或其他工具择一取皮肤组织块，取皮方式按照“活检取样法”或手术取样的标准流程操作将取下的皮肤组织块浸泡于组织块保存液(或含双抗的PBS、生理盐水)中；

步骤(2)：将浸泡后皮肤组织块转移至含双抗的PBS(或生理盐水)中洗涤5～8遍，以在分离细胞前洗去血丝，并防止污染；

步骤(3)：修剪皮肤组织并去除皮下组织、脂肪及残留毛细血管，把皮肤组织剪切成小块；

步骤(4)：将皮肤组织块转移至培养皿里，加选择性培养基润湿组织块，使组织块不易干燥，并促进成纤维细胞爬出。放置37℃，5％CO₂培养箱静置1～2h。期间不可移动培养皿。