[发明专利]长春花中艾里莫芬烷倍半萜的生物合成基因及应用

说明书

本发明公开了长春花(Catharanthus roseus)中艾里莫芬烷倍半萜5‑epi‑jinkoh‑eremol和debneyol生物合成基因对及其应用。整个基因对包含2个基因：一种编码萜类合酶CrTPS3基因和一种编码细胞色素P450酶CrCPY基因。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断或提高5‑epi‑jinkoh‑eremol和debneyol的生物合成。本发明所提供的基因及其蛋白可用于5‑epi‑jinkoh‑eremol和debneyol化合物的基因工程、蛋白表达、酶催化反应等，也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

技术领域

本发明属于植物基因工程和医药技术领域，具体涉及一类具有抗菌作用的艾里莫芬烷倍半萜5-epi-jinkoh-eremol和Debneyol的生物合成方法及应用。

背景技术

植物真菌病是由植物病原真菌引起的病害。约占植物病害的70～80％，是经济植物减产的主要原因之一。在一种作物中可发现几种甚至几十种真菌病害，常见有霜霉、白粉、白锈、黑粉、锈粉、烟霉、黑痣、霉状物、蘑菇状物、棉絮状物、颗粒状物、绳索状物、粘质粒和小黑点等。农作物感病后引起产量下降和品质变劣，有些病原真菌(如镰刀菌、黄曲霉菌)在侵染植物过程中，还产生多种对人畜有害的真菌毒素，影响食品安全。许多真菌病害在环境条件不适宜时完全不表现病征。真菌病害的侵染循环类型最多，许多病菌可形成特殊的组织或孢子越冬，危害周期长，造成巨大经济损失。现阶段应对植物真菌病害方法有限，除选用优良抗病品种、加强栽培管理外，主要依靠施药防治。现有植物真菌防治药物多是微生物来源，具有环境不友好、易耐药、易残留等缺点。因此，寻找新的高效的植物来源的抗植物真菌药物迫在眉睫。

植物中的萜类化合物在其自身化学防御体系中发挥着重要作用，因此往往具有较强的抗真菌和抗细菌作用。艾里莫芬烷(eremophilane)倍半萜存在于多种植物中，研究发现多种艾里莫芬烷倍半萜衍生物具有抗肿瘤作用。此外，艾里莫芬烷倍半萜还具有较强的抗真菌作用。其中从病毒感染的烟草中发现的艾里莫芬烷倍半萜debneyol对黄瓜黑星病菌Cladosporium cucumerinum、豆刺盘孢Colletotrichum lindemuthianum等真菌具有较好的抑制作用，提示艾里莫芬烷倍半萜debneyol及其类似物具有抗植物真菌病害的作用[Phytochemistry,24,2191-219(1985)]。目前，主要通过从植物中提取或化学全合成的方法来获得艾里莫芬烷类倍半萜，具有能耗高，环境不友好等缺点。通过挖掘植物基因资源，利用生物合成方法生产艾里莫芬烷类倍半萜，有助于深入发现新的植物来源的具有抗植物真菌病害的艾里莫芬烷倍半萜，对该类倍半萜的开发利用具有现实意义。

发明内容

本发明的目的在于为了克服微生物来源的植物真菌病害抗菌剂所存在的不足，通过对具有较强抗病菌能力的药用植物长春花进行基因组数据分析和生化功能验证，确定了艾里莫芬烷倍半萜5-epi-jinkoh-eremol、debneyol生物合成相关基因对CrTPS3-CrCYP。确定了5-epi-jinkoh-eremol、debneyol在植物化学防御中的抗菌作用。

本发明提供了一种编码萜类合酶CrTPS3的核苷序列，其核苷序列位于SEQ IDNO.1中第1-1686碱基处，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明还提供了一种编码细胞色素P450酶CrCYP的核苷序列，其核苷序列位于SEQID NO.1中第1687-3201碱基处，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

本发明还提供了含有所述CrTPS3和CrCYP编码基因的重组表达质粒和含有重组质粒的重组微生物大肠杆菌Escherichia.coli C41(DE3)和酿酒酵母Saccharomycescerevisiae BY4741。