[发明专利]一种高通量简易细胞O-糖基化位点的富集、鉴定方法

权利要求书

1.一种高通量简易细胞O-糖基化位点的富集、鉴定方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）通过在细胞培养环境中加入O-GalNAc糖链合成抑制剂，使O-GalNAc糖链合成抑制在单个GalNAc的水平；

（2）然后通过超滤辅助凝集素富集技术实现O-GalNAc糖肽的富集，利用单糖竞争机制释放富集到的O-GalNAc糖肽；其中包括：

（a）加入PNGase F和唾液酸酶去除N-糖链和唾液酸；

（b）用C18小柱对酶解后的肽段除盐，随后冻干；

（c）将凝集素与除盐后的肽段一起孵育；

（d）将孵育后的凝集素溶液转移至超滤管，进行超滤，并清洗5次以上，洗去未与凝集素结合的非糖蛋肽；

（e）在体系中加入终浓度0.1~1mol/L的GalNAc，孵育0.5~2 h，通过单糖竞争作用，将与凝集素结合的O-GalNAc糖肽释放下来；

所述凝集素为长柔毛野豌豆外源凝集素；

（3）最后通过LC-MS，高通量鉴定O-GalNAc糖基化位点；

O-GalNAc糖链合成抑制剂为Benzyl2-acetamido-2-deoxy–α -D-galactopyranoside；

流程（1）中加入抑制剂的浓度为1~10mM；

流程（2）中，细胞在抑制剂环境下培养的时间为24~48h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体操作流程为：

（1）将O-GalNAc糖链合成抑制剂加入细胞培养基中；

（2）细胞在含抑制剂的培养基中培养；

（3）弃去培养基，用PBS清洗3次后进行常规的细胞收集、蛋白裂解和胰酶酶解；

（4）加入PNGase F和唾液酸酶去除N-糖链和唾液酸；

（5）用C18小柱对酶解后的肽段除盐，随后冻干；

（6）将凝集素与除盐后的肽段一起孵育；

（7）将孵育后的凝集素溶液转移至超滤管，进行超滤，并清洗5次以上，洗去未与凝集素结合的非糖蛋肽；

（8）在体系中加入终浓度0.1~1mol/L的GalNAc，孵育0.5~2 h，通过单糖竞争作用，将与凝集素结合的O-GalNAc糖肽释放下来；

（9）超滤，并清洗2~5次，合并收集的O-GalNAc糖肽和GalNAc的混合溶液；

（10）通过C18小柱除盐除去体系中的盐和GalNAc，随后冻干；

（11）做LC-MS分析，鉴定O-GalNAc糖基化位点。

3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，流程（4）中，加入的PNGase F和唾液酸酶以300~500 U对应1 mg起始蛋白的比例加入，37℃孵育14~18小时。

4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，流程（6）中，凝集素加入的浓度为1~5 微克/微升；室温孵育，孵育时间为0.5~3 h，孵育以及超滤的溶液为10~100 mMTris/HCl pH为7~8,0~2mM MnCl 2 , 0~2mM CaCl 2 , 0~2 MNaCl。