[发明专利]一种沙门氏菌免疫磁珠的制备方法

说明书

本发明公开了一种沙门氏菌免疫磁珠的制备方法，通过优化磁珠活化体系，与常用的EDC/NHS体系活化操作相比，更加简单高效。通过使用两种不同捕获性能的抗体以特定的比例混合，显著降低了免疫磁珠的漏检率。通过将制得的免疫磁珠保存在特定组成的保存液中，使免疫磁珠可以在4～8℃保存条件下一年内维持较高的活性，确保了免疫磁珠在保存与使用过程中性能的稳定，为免疫磁珠在实际检测中的应用提供了保障。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种沙门氏菌免疫磁珠制备方法。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是最常见的人畜共患致病菌之一，在动物性产品中广泛存在，如肉制品、蛋、奶类等，这些食物广泛分布，因而沙门氏菌引起的食源性疾病爆发时很难溯源。食品中极少数的沙门氏菌即可引发食用者患病，目前全球包括我国国家标准对食品中沙门氏菌的限制都是禁止检出。

传统的生化鉴定方法操作较为复杂，耗时长。与传统生化鉴定方法相比，分子学检测方法具有快速、检测限低、准确度高等优势。但分子学检测方法应用的前提是获得不含基因片段扩增抑制因素的高质量DNA模板。通常情况下，实际样本中背景菌的含量远高于目标菌的含量，加之食品基质多样且复杂，给目标菌的分离带来了很大的难度。

目前用于食品样本中目标菌分离和富集的方法包括过滤和免疫吸附技术。过滤的方法最大的应用限制是滤膜会被样本基质中的颗粒堵塞，过滤的样本量有限，且样本也会损失从而无法准确定量。免疫吸附技术如免疫磁珠是从复杂的基质如食品、临床、环境样本中分离并富集到目标菌的行之有效的方法。

免疫磁珠是对具有超顺磁性的微粒表面进行化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能捕获特异性抗原的磁珠。将免疫磁珠与待测溶液混合，如有相应抗原存在，免疫磁珠就会将其捕获，形成抗原-免疫磁珠复合物，并在适当的磁场条件下分离出来，达到富集目标抗原的目的。

磁珠表面修饰的配基一般为-COOH、-NH₂、甲苯磺酰基、链霉亲和素等。免疫磁珠的制备方法根据磁珠上修饰配基的不同而有所差别。不同抗体分子在具有负电荷的表面如-COOH基团，比在正电荷的表面有更倾向于Fc区域朝下的取向，即Fab区域更多的暴露在表面的最外面，可以自由的与抗原相结合。虽然通过调节表面带电荷的方法能够在一定比例上改善抗体分子在表面的取向结构，但是这种方法基于的结合力是分子间作用力如氢键，静电力等，并不是特异性的结合力，所以抗体最终在界面呈混合取向状态，造成最终偶联效率低的情况。

一般情况下，制备免疫磁珠基本采用单株抗体。但是沙门菌血清型繁多，已确认的高达2523个，我国已发现的也有292个，使用单株抗体检测时容易出现漏检的情况，限制了免疫磁珠的使用。理论上，在磁珠上偶联两种或更多种抗体有望降低甚至消除漏检的情况，但是目前商品化的沙门氏菌抗体种类较少，并且还需要有效果的筛选平台(如沙门氏菌优势血清型菌种库)才能对抗体进行有意义的筛选。对筛选到的性能互补的抗体进行合理配比是改善免疫磁珠漏检现象的有效方式。

另外，免疫磁珠因偶联有抗体，活性容易在使用及保存过程中损失。因冷冻保存会造成磁珠的聚集结团从而使性能下降，所以也不能像抗体一样进行冷冻保存。免疫磁珠较为适合的保存温度是4～8℃，市场上鲜有免疫磁珠商品化保存液出售，因此需要开发一种适用于免疫磁珠4～8℃保存液。

发明内容

本发明的一个目的在于克服现有的技术的不足，提供一种漏检率低，检测效果好的沙门氏菌免疫磁珠的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种长期保存上述沙门氏菌免疫磁珠的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种沙门氏菌免疫磁珠的制备方法，包括如下步骤：

1)将羧基磁珠清洗干净，分散于超纯水中；