[发明专利]一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶及其解脂耶氏酵母菌株的构建方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶的制备方法，包括以下步骤；步骤一、在pinA1297质粒上插入胰蛋白酶序列和谷氨酰胺转氨酶酶原序列；步骤二、将步骤一获得的质粒转化解脂耶氏酵母菌株Yarrowia lipolytica polh中；步骤三、将步骤二获得的菌株在YPD培养基中培养、在PPB培养基中发酵，获得谷氨酰胺转氨酶；步骤四、将获取的胰蛋白酶和谷氨酰胺转氨酶酶原分别表达并分泌到细胞外，在胞外蛋白酶切除谷氨酰胺转氨酶酶原的酶原区，获得有活性的谷氨酰胺转氨酶，本发明发酵中不需诱导或添加抗生素，能用于食品和药品的生产，易于培养，发酵方法简单，周期短，重组表达谷氨酰胺转氨酶，不用体外活化，简化谷氨酰胺转氨酶生产工艺，降低生产成本。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶及其解脂耶氏酵母菌株的构建方法。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶又称转谷氨酰胺酶（TG酶）是由331个氨基组成的分子量约38000的具有活性中心的单体蛋白质，其可催化蛋白质多肽发生分子内和分子间发生共价交联，从而改善蛋白质的结构和功能，对蛋白质的性质如：发泡性，乳化性，乳化稳定性，热稳定性、保水性和凝胶能力等效果显著，进而改善食品的风味、口感、质地和外观等；

目前人们对解脂酵母的研究愈来愈多，解脂酵母作为一种非常规的安全酵母被更多的拿来生产，解脂酵母在生产柠檬酸，脂肪酸以及番茄红素上都有巨大的优势，由于解脂酵母中的油滴比酿酒酵母大，所以可以更好的容纳一些疏水产品，这些疏水产品储存在油滴中减轻对细胞的毒害作用，解脂酵母可以将很多物质作为自己的碳源，并且在各种碳源中都能获得较大的生物量；

现有的在解脂耶氏酵母中表达重组谷氨酰胺转氨酶的方法是先表达谷氨酰胺转氨酶酶原，然后外加蛋白酶，进行活化，由于先表达谷氨酰胺转氨酶酶原，再外加蛋白酶活化，相比较直接表达谷氨酰胺转氨酶，工艺更复杂，增加了原料成本、设备成本和分离成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶及其解脂耶氏酵母菌株的构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

设计一种重组表达活性谷氨酰胺转氨酶的制备方法，包括以下步骤；

步骤一、在pinA1297质粒上插入胰蛋白酶序列和谷氨酰胺转氨酶酶原序列，获得pinA1297/trypsin-proTGase质粒；

步骤二、将步骤一获得的质粒转化解脂耶氏酵母菌株Yarrowia lipolytica polh中，获得Y. lipolytica Po1h/trypsin-proTGase菌株；

步骤三、将步骤二获得的菌株在YPD培养基中培养、在PPB培养基中发酵，获得谷氨酰胺转氨酶；

步骤四、将获取的胰蛋白酶和谷氨酰胺转氨酶酶原分别表达并分泌到细胞外，在胞外蛋白酶切除谷氨酰胺转氨酶酶原的酶原区，获得有活性的谷氨酰胺转氨酶。

优选的，步骤三中，发酵方法为：

S1、挑取保藏的菌株菌落于25mlYPD培养基中；

S2、在28℃，220rpm的速度下摇动，进行培养20-24h；

S3、转接到25ml的PPB培养基中，接种量是10-15%，在28℃，220rpm的速度下摇动，发酵110-120h。

优选的，步骤三中，所述YPD培养基由6.7g YNB，20g葡萄糖，121℃灭菌15min生成。