[发明专利]一种检测百日咳杆菌的试剂盒

说明书

本发明公开了百日咳杆菌的基于LAMP技术的检测试剂盒。LAMP引物根据百日咳杆菌的特异保守序列设计，每组引物包含4条寡核苷酸，通过LAMP反应体系利用恒温扩增仪对百日咳杆菌进行荧光鉴定检测。本发明为百日咳杆菌测提供了一个新的技术平台，适宜在基层单位、现场监测和床旁检测中推广应用。

技术领域

本发明属于以等温扩增为代表的分子生物学检测方法在百日咳杆菌检测方面的应用，即百日咳杆菌的环介导等温扩增检测方法和试剂盒。

背景技术

百日咳杆菌（Bordetella pertussis）为卵圆形短小杆菌，大小为0.5～1.5×0.2～0.5um，属鲍特氏菌属Bordetella，无鞭毛、芽胞。百日咳杆菌主要经飞沫传播，可引起人类百日咳，易感儿童接触病人后发病率接近90%，一岁以下患儿病死率高。百日咳潜伏期1～2周。发病早期（卡他期）仅有轻度咳嗽。细菌此时在气管和支气管粘膜上大量繁殖并随飞沫排出，传染性最大，且该病病程较长，故名百日咳。百日咳杆菌以分离培养为主，标本采用鼻咽试子或咳皿法，根据菌落形态，涂片染色镜检作出初步诊断。确诊可用分离菌与Ⅰ相免疫血清作血清玻片凝集或免疫荧光染色。

近年来，分子生物学方法不断被应用到呼吸道病原体的快速检测中，呼吸道病原体的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了呼吸道病原体实验室诊断的发展方向。相对于传统的实验室检测法，分子诊断技术具有无可比拟的检测速度、特异性和灵敏度，已成为实验室诊断的新标准。

其中，环介导等温扩增法具有检测灵敏度高、结果判断直观，且不需要荧光定量PCR仪等价格昂贵的设备等优点，具有广泛应用前景。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新型等温核酸扩增技术，具有快速、简便、经济、灵敏等优点，目前已被广泛应用于核酸快速检测领域。LAMP的原理是针对靶基因上6个区域设计2对引物(FIP[F1c+F2]、BIP[B2+B1c]、F3、B3)，在链置换型DNA聚合酶的作用下，于等温条件在短时间内（15~90min）进行核酸扩增。

在反应液中添加荧光物质SYBR GREEN，利用恒温扩增仪检测荧光曲线，有荧光曲线表示待测样品中存在百日咳杆菌（阳性），无扩增曲线表示待测样品中无百日咳杆菌（阴性）。与传统PCR相比，LAMP具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果判定简单、成本低廉等特点。LAMP检测灵敏度至少比普通PCR 高出2个数量级。此外，等温扩增仅需一个水浴锅或恒温装置，对设备的要求简单，其操作过程耗时较短，可在1小时内完成。通过SYBR GREEN等荧光染料对PCR扩增产物的显色，LAMP反应结果的检测可通过等温扩增仪进行可视化呈现，是一种高效、简便、快捷、高通量的检测方法。

因此，开发一种针对百日咳杆菌的环介导等温扩增试剂盒具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种用于百日咳杆菌核酸检测的方法；另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。

1. 百日咳杆菌的LAMP检测专用引物

根据百日咳杆菌基因组特异性保守序列，应用在线引物设计软件Primer ExplorerV5，上传靶序列后，即可初步得到多组引物序列。