[发明专利]一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法

权利要求书

1.一种多DNA片段PCR扩增的方法，其特征在于，利用一种用于重叠延伸PCR的引物组合进行PCR扩增，所述引物组合，包括一对用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物和扩增各目的片段的片段扩增引物，用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物，其核苷酸序列如SEQID No.1～2所示；

最上游的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.1所示序列，

其余的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物5’端加上其上游的目的片段3’端的碱基18～23个碱基，

最上游的扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.2所示序列；

其余扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物的，

其中所述常规设计的上游引物和下游引物与权利要1所述引物Tm值相差3～8℃；

所述方法PCR扩增的体系为：GeneAmp^TM 10×PCR BufferI 3μl，25mM Mg²⁺ 2.5μl，25mMdNTPs 0.3μl，每条引物各1μl，Roche Taq酶0.5μl，模板1μl，H₂O补足至25μl；

所述方法PCR扩增的程序为：95℃ 9min；95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，10个循环；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，30个循环；72℃ 5min；16℃ ∞。

2.一种多DNA片段PCR扩增的试剂盒，其特征在于，包括一种用于重叠延伸PCR的引物组合进行PCR扩增，所述引物组合，包括一对用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物和扩增各目的片段的片段扩增引物，用于重叠延伸PCR的通用全长扩增的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示；

最上游的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.1所示序列，

其余的扩增片段的5’端上游片段扩增引物为该片段的常规设计的上游引物5’端加上其上游的目的片段3’端的碱基18～23个碱基，

最上游的扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物5’端加上核苷酸序列如SEQ ID No.2所示序列；

其余扩增片段的3’端下游片段扩增引物为常规设计的下游引物的，

其中所述常规设计的上游引物和下游引物与权利要1所述引物Tm值相差3～8℃；

还包括PCR反应的试剂：GeneAmp^TM 10×PCR Buffer I、25mM Mg²⁺、25mM dNTPs、RocheTaq酶、H₂O；

PCR扩增的体系为：GeneAmp^TM 10×PCR Buffer I 3μl，25mM Mg²⁺ 2.5μl，25mM dNTPs0.3μl，每条引物各1μl，Roche Taq酶0.5μl，模板1μl，H₂O补足至25μl；

PCR扩增的程序为：95℃ 9min；95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，10个循环；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，30个循环；72℃ 5min；16℃ ∞。

3.一种多DNA片段位点检测的方法，其特征在于，用权利要求1所述方法进行多DNA片段PCR扩增后，用核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示引物进行的Sanger测序。