[发明专利]基于CRISPR/Cas9的小菜蛾APN3a基因的敲除和应用在审
| 申请号： | 201811642692.4 | 申请日： | 2018-12-29 |
| 公开（公告）号： | CN109679954A | 公开（公告）日： | 2019-04-26 |
| 发明（设计）人： | 郭兆将;孙丹;康师;郭乐;周君雷;龚莉君;覃舰莹;朱流红;白杨;罗亮;张友军 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/90 |
| 代理公司： | 北京知本村知识产权代理事务所 11039 | 代理人： | 刘江良 |
| 地址： | 100081 北*** | 国省代码： | 北京;11 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 小菜蛾 基因 敲除 应用 理论和实践意义 非模式生物 田间 编辑系统 纯合突变 功能基因 基因突变 机制研究 抗性分子 抗性水平 生物测定 突变个体 稳定遗传 无损检测 显微注射 小菜蛾卵 高抗性 基因型 抗性 靶标 毒力 构建 种群 筛选 检测 防治 | ||
1.一种基于CRISPR/Cas9技术的小菜蛾APN3a基因的敲除方法。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，设计并合成小菜蛾APN3a基因特异性sgRNA靶标序列，将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到小菜蛾前胚盘期卵后极部位。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，以小菜蛾四龄幼虫新鲜蛹蜕的痕量gDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增和直接测序鉴定G0代突变个体，G0代突变个体相互交配获得G1代，直接和TA测序鉴定后选取数量足够且具有相同突变型的杂合子个体进行自交获得G2代，TA测序鉴定得到能稳定遗传的G2代纯合子个体，随后自交获得G3代的APN3a纯合基因突变型种群。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，sgRNA靶标序列设计在小菜蛾APN3a基因编码区的第13个外显子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，sgRNA靶标位点的合成引物为：
CRISPR正向引物如SEQ ID NO. 2所示，以及CRISPR反向引物如SEQ ID NO. 3所示。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgRNA终浓度为150 ng/μl，Cas9蛋白的终浓度为300 ng/μl。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，利用正向引物SEQ ID NO. 4和反向引物SEQID NO. 5可以特异性扩增APN3a基因sgRNA靶标位点附近的gDNA序列。
8.一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的小菜蛾APN3a基因敲除试剂盒，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示sgRNA靶标序列和Cas9蛋白。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括配套的检测试剂，用于检测所述基因的剪切效果和评估基因敲除效率。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO.3所示序列的引物；以及SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示序列的引物。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于中国农业科学院蔬菜花卉研究所，未经中国农业科学院蔬菜花卉研究所许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201811642692.4/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
