[发明专利]一种自体外周血淋巴细胞的培养方法

权利要求书

1.一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)首先，从外周血中分离外周血单个核细胞，然后，按照密度1×10⁶加入适量无血清细胞培养液中，并加入浓度为1000-2000U/ml的干扰素-γ，置于培养箱静置培养3天，得到初次培养液；

(2)首先，将细胞表面分子3单克隆抗体与细胞表面分子16单克隆抗体进行预先包被，然后将步骤(1)中培养的单个核细胞转移至含细胞表面分子3单克隆抗体与细胞表面分子16单克隆抗体的培养瓶中，等倍补加无血清细胞培养液，并加入浓度为1000-2000U/ml的干扰素-2，置于培养箱静置培养3天，得到二次培养液；

(3)首先，将步骤(2)所得二次培养液补加500-1000mL的细胞培养液，然后加入1000-2000U/ml的干扰素-2，置于培养箱静置培养3天，制得三次培养液；

(4)首先，将步骤(3)所得三次培养液继续补加500-1000mL的细胞培养液，置于培养箱静置培养3天，重复此步骤2-3次，制得自体外周淋巴细胞。

2.如权利要求1所述的一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中外周血的分离方法为：首先，将采集的每50mL外周血加入5IU肝素钠后与新鲜抗凝血10mL与Hanks液1:1混匀的混合液混合后，置于转速为1800r/min的低速台式离心机离心15min，然后，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，最后，经洗涤液洗涤2次后，按每毫升血液标本加0.2mL含20％小牛血清的Hank′s液重新混悬细胞37℃、5％CO₂孵育箱中培养2h后去除上清，得到贴壁的单核细胞。

3.如权利要求1所述的一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，其特征在于：步骤(1)-(4)中静置培养的条件为温度37℃、相对湿度为100％、CO₂含量为5％的CO₂培养箱内培养。

4.如权利要求1所述的一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中的无血清培养液添加有以下组分：10％自体血浆、干扰素-γ，1000-2000U/ml、植物凝集素P，500～1000ng、白细胞介素1α、100～200U。

5.如权利要求2所述的一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中细胞表面分子3单克隆抗体添加量为50-100ng，细胞表面分子16单克隆抗体添加量为50-100ng。

6.如权利要求4所述的一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中制得的自体外周淋巴细胞离心后经洗涤去除培养液后，重悬于保存液中。