[发明专利]快速检测GFAP的荧光免疫层析试纸条及其制备与应用

权利要求书

1.一种快速检测GFAP的荧光免疫层析试纸条，包括底板，沿底板长度依次设置的样品垫、结合物释放垫、层析膜及吸水垫，所述的层析膜上设有检测线与质控线，所述的检测线与质控线相互分离，其特征在于，所述的结合物释放垫上固定有荧光微球标记GFAP单克隆抗体的荧光探针，所述检测线处包被有与微球标记抗体配对的GFAP抗原，所述的质控线处包被有羊抗鼠IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测GFAP的荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合物释放垫为玻璃纤维材质，所述层析膜采用硝酸纤维素膜，所述样品垫上设有加样孔。

3.如权利要求1所述快速检测GFAP的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备荧光微球标记GFAP单克隆抗体的荧光探针；

(2)用浸泡结合物释放垫的方式将制备的荧光探针固定在结合物释放垫上，冷冻干燥后，密封保存备用；

(3)包被GFAP抗原及羊抗鼠IgG抗体划线于层析膜上，分别为检测线和质控线；

(4)将样品垫、结合物释放垫、层析膜与吸水垫粘帖在底板上，组成快速检测GFAP的荧光免疫层析试纸条。

4.根据权利要求3所述快速检测GFAP的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述GFAP抗原的制备方法为：

1.1、表达质粒的构建：

1.1.1双酶切：确定GFAP基因两侧的内切酶；

1.1.2连接：将目的片段与载体片段连接后转染目的菌株；

1.1.3转菌：转菌涂平板，通过菌落PCR鉴定片段的存在；

1.1.4菌种保存：挑取阳性菌落在合适的抗性LB培养基培养并用灭菌甘油保存；

1.2、重组蛋白的表达和纯化：

1.2.1培养：挑取含有GFAP表达质粒，接种入LB培养基中，震荡培养；

1.2.2诱导表达：用IPTG诱导，E.coli表达GFAP并收集菌体；

1.2.3蛋白纯化：菌体破碎后过镍柱，用咪唑洗脱纯化蛋白；

1.3、重组蛋白的鉴定：

1.3.1纯化蛋白采用SDS-PAGE的方法鉴定纯度；

1.3.2采用GFAP试剂盒鉴定目的蛋白是否正确收集。

5.根据权利要求3所述快速检测GFAP的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述GFAP单克隆抗体的制备方法为：

2.1、动物免疫：GFAP蛋白对Balb/C小鼠进行免疫；

2.2细胞融合：利用免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；

2.3细胞筛选：利用有限稀释法结合间接ELISA方法来筛选得到阳性单克隆杂交瘤细胞；

2.4抗体制备：利用小鼠腹水来体外扩增富集单克隆抗体；

2.5抗体纯化：利用辛酸-硫酸铵法和亲和层析法对腹水进行纯化，透析后测定A280确定蛋白浓度待用。

6.根据权利要求3所述快速检测GFAP的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述荧光微球标记GFAP单克隆抗体的荧光探针中，所述荧光微球是时间分辨荧光微球；

所述荧光微球标记GFAP单克隆抗体的荧光探针的方法为：

(1)、用NHS及EDC溶液活化微球；

(2)、充分混匀后，静置；

(3)、将GFAP单克隆抗体加入到活化好的微球中，使微球的终浓度为0.5mg/ml，先静置偶联，再静置过夜；

(4)、在偶联好的微球中加入封闭液和10％Tween-20，混匀，静置；

(5)、离心清洗微球；

(6)、吸去上清后，加入微球保存液，分散均匀，即为荧光微球标记GFAP单克隆抗体的荧光探针。