[发明专利]一种禽减蛋综合征病毒培养方法及其在疫苗中的应用

说明书

一种禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法，包括以下步骤：(1)在EB66悬浮传代细胞系中驯化禽减蛋综合征病毒，得到种毒；(2)将EB66细胞接种至生物反应器，使其在pH＝7.20±0.1的条件下进行悬浮培养；(3)按禽减蛋综合征病毒与细胞培养基体积比2/1000的比例，将步骤(1)所得种毒接种EB66细胞，培养pH＝7.40±0.1，在病毒效价达到最高时收获病毒液并保存。采用上述方法制得病毒液具有高纯度、高滴度的特点，将其灭活后制备的禽减蛋综合征疫苗具有生产工艺稳定、批间差异小、质量可控、产量和质量显著提高等优点。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体地，涉及一种禽减蛋综合征病毒培养方法及其在疫苗中的应用。

背景技术

鸡减蛋综合症(EDS)是一种使产蛋鸡或种母鸡产蛋率下降的病毒性传染病。产蛋鸡感染EDS病毒后，鸡群产蛋量无法达到高峰期或产蛋量大幅下降，可使产蛋量下降20％～30％，严重影响到蛋鸡产业的发展，给广大养殖户及养殖企业带来巨大的经济损失，危害性非常严重。免疫接种是预防本病的主要措施，鸡群在进入产蛋前全部产生抗体，产蛋将不受影响。

目前，我国鸡减蛋综合症疫苗的生产主要采用鸭胚培养制备疫苗，由于目前我国还没有SPF鸭胚，无法保证鸭胚来源，鸭胚中有可能含有其它病毒，对其所繁殖EDS病毒的效价造成很大影响，造成不同批次间的疫苗质量差异巨大。同时鸭胚培养的病毒悬液中含有大量异源蛋白，疫苗副反应大，急需选择新的EDS疫苗生产介质。

近年来，利用悬浮培养工艺培养病毒制备疫苗已成为世界疫苗制备企业的发展趋势，利用无血清、化学成分界定的培养基全悬浮培养生产工艺可以克服传统鸭胚疫苗制备的缺点，大大提高疫苗品质，降低综合成本。随着细胞悬浮工艺的发展，能够适应悬浮培养的细胞种类众多，然而，现有报道中应用于悬浮培养的细胞系表面的EDS病毒受体丰度低，或者其胞内环境无法满足EDS病毒的营养需求，造成病毒液滴度低，给EDS疫苗的大规模制备造成了极大的困难。此外，细胞系、病毒的培养增殖工艺也会影响病毒液的品质和滴度。目前，关于利用细胞悬浮技术培养高滴度的EDS病毒液并将其应用到禽类免疫中的技术仍未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法及其在制备禽减蛋综合征疫苗中的应用，以解决上述技术问题中的至少一个。

根据本发明的一个方面，提供一种禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法，包括以下步骤：(1)按禽减蛋综合征病毒与细胞培养基体积比2/1000的比例接种EB66细胞，接毒后置于培养箱中悬浮培养，取HA效价最高时收获的病毒液进行传代，连续传代培养10代，得到种毒；(2)将EB66细胞接种至生物反应器，使其在pH＝7.20±0.1的条件下进行悬浮培养；(3)按禽减蛋综合征病毒与细胞培养基体积比2/1000的比例，将步骤(1)所得种毒接种EB66细胞，培养pH＝7.40±0.1，在病毒效价达到最高时收获病毒液并保存。

优选地，，在步骤(3)中，当EB66细胞的细胞密度达到1.0×10⁶cells/mL-2.0×10⁶cells/mL，将禽减蛋综合征病毒接种所述EB66细胞。

优选地，在步骤(2)中，将EB66细胞按0.35×10⁶cells/mL-0.75×10⁶cells/mL的细胞密度接种至生物反应器。

优选地，EB66细胞的培养条件是37℃，5％CO₂。

优选地，步骤(2)的培养转速为80rpm，步骤(3)的培养转速为120rpm。

优选地，细胞培养基为无血清培养基。

优选地，无血清培养基为CD EB66(DP210)培养基。

优选地，禽减蛋综合征病毒为禽减蛋综合征病毒K-11株。