[发明专利]示踪猪GADD45a亚细胞定位的方法及用途

说明书

本发明公开了一种猪GADD45a荧光示踪表达载体的构建方法，包括以下步骤：根据pEGFP‑N1载体的信息和猪GADD45a全长基因序列设计并合成扩增GADD45a全长的引物Ⅰ，同时根据pEGFP‑N1载体上的XhoI酶切位点，设计含有载体末端15‑25bp同源臂的目的基因的引物Ⅱ；将扩增得到的基因片段割胶回收，然后与线性化的pEGFP‑N1载体同源重组，将同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选、鉴定后，构建得到带绿色荧光报告基团的pEGFP‑GADD45a的重组质粒；其能用于研究示踪猪GADD45a在不同细胞中的定位。本发明开拓了目前研究猪GADD45a功能及其定位方面研究的新思路。

技术领域

本发明涉及一种示踪猪GADD45a(growth arrest and DNA damage induciblealpha)亚细胞定位的方法建立及用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。

背景技术

GADD45a(又叫DDIT1)是生长阻滞和DNA损伤诱导基因家族成员之一，参与调控细胞周期、细胞凋亡、细胞衰老和肿瘤发生发展等。在多种因素诱导的细胞应激及DNA损伤应答调控网络中发挥重要生物学功能，抑制细胞增殖、促进凋亡；还可以通过阻滞细胞周期、修复DNA损伤和促进细胞凋亡等途径减少细胞癌变的可能和肿瘤的发生。p53基因是一个广谱抑癌基因，参与细胞周期、细胞生长、细胞凋亡、DNA损伤和修复的调控，在基因调控网络中具有中枢地位。GADD45a是第一个被检出的p53的下游基因，是一个能够识别基因组损伤的重要生物标志物。也是BRCA1的下游基因。GADD45a可由UV放射、低氧、离子辐射、基因毒性药物等损伤因素快速诱导产生，可以通过p53依赖及非依赖两条途径被诱导表达增高，在调控细胞周期、维持基因组稳定性、细胞凋亡、DNA损伤修复以及信号传导等重要细胞生命活动中起重要作用。

猪GADD45a基因的mRNA序列有1527bp，一共4个外显子，编码序列全长为498bp，编码165个氨基酸，编码约18kD的蛋白。但是，目前关于猪GADD45a的研究报道甚少，未见关于猪GADD45a亚细胞定位的相关研究。最近研究也发现，GADD45A可以调控脂肪细胞分化聚酯。在猪上，GADD45a可能与肌内脂肪沉积密切相关。因此，开展GADD45a亚细胞定位及其在糖脂代谢中的功能研究具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种猪GADD45a亚细胞地位的研究方法建立，以及该方法的用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种猪GADD45a荧光示踪表达载体(pEGFP-GADD45a，即，带EGFP荧光报告基团的GADD45a表达载体)的构建方法，包括以下步骤：

1)、根据pEGFP-N1载体的信息和猪GADD45a全长基因序列(靶序列)设计并合成扩增GADD45a全长的引物Ⅰ，同时根据pEGFP-N1载体上的XhoI酶切位点，设计含有载体末端15-25bp同源臂的目的基因(GADD45a基因)的引物Ⅱ；

注：设计上述目的基因的下游引物时必须使目的基因与GFP在同一阅读框；

2)、GADD45a荧光示踪表达载体(pEGFP-GADD45a)的构建：将利用含有载体末端15-25bp同源臂的GADD45a基因引物扩增得到的基因片段割胶回收，然后与线性化的pEGFP-N1载体同源重组，将同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选(卡那霉素平板)、鉴定(PCR鉴定满足扩增条带大小约500bp；测序鉴定满足序列与猪GADD45a序列一致)后，构建得到带绿色荧光报告基团的pEGFP-GADD45a的重组质粒。

即：全长序列克隆和同源重组：扩增出两端含同源臂的PCR产物，切胶回收。使用Trelief^TM SoSoo Cloning Kit Ver.2试剂盒进行同源重组，构建pEGFP-GADD45a的重组质粒，转化大肠杆菌，并挑选单克隆测序验证。