[发明专利]基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法

说明书

本发明公开了基于实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增技术的鲤春病毒血症病毒检测方法，包括如下实验步骤：提取病毒RNA；设计Real‑time RT‑RPA引物与探针；建立Real‑time RT‑RPA反应体系，对病毒RNA进行Real‑time RT‑RPA反应，实时荧光检测结果。本发明的优点包括：简单、快速、低成本地检测出SVCV，Real‑time RT‑RPA检测方法与Real time RT‑PCR检测方法灵敏度一致，都是10²copies/μL；特异性好，重复性好，稳定。

技术领域

本发明涉及病毒的检测技术领域，尤其涉及鲤春病毒血症病毒的检测技术。

背景技术

鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia ofcarp virus(SVCV))属于水疱病毒属，弹状病毒科，有一层囊膜，病毒大小为180×70nm，含单链RNA和依赖于RNA 的RNA聚合酶，它可引起鲤鱼类大规模鲤春病毒血症爆发。SVC是一种急性出血性性传播疾病，它是鲤科鱼类最严重的病毒性疾病之一，被国际动物卫生组织(OIE)列为法定报告病。主要的临床症状包括发炎的发泄，皮肤瘀斑和腹胀。当水温在10到17℃之间，病毒潜伏约20天后会发生疾病。SVCV首次在欧洲被发现并广泛传播，但近年来，在美国和中国已经发生，这对水产养殖业构成了巨大威胁。到目前为止，SVCV已在欧洲，俄罗斯，北美洲和南美洲以及亚洲广泛传播。然而，到目前为止，还没有开发出有效的药物或疫苗来预防由 SVCV引起的疾病。阻止其流通的唯一有效方法是在有效识别并杀死所感染的鱼。因此，快速可靠的诊断方法对SVCV的预防和控制具有重要意义。

已经开发了几种用于诊断SVCV的方法，其包括间接荧光抗体测试，酶联免疫吸附测定(ELISA)，细胞培养中的病毒分离和病毒中和，半巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和环介导等温扩增技术(LAMP)。但这些方法的拥有一定的缺点：ELISA方法依赖于特异性抗血清，针对欧洲分离株的单克隆抗体通常不能与亚洲分离株反应；LAMP方法需要多个复杂的引物；对于巢式PCR 方法，它通常需要几个小时，并需要昂贵的仪器。

重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种很有前途的等温核酸扩增技术，它依赖于重组酶，单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶的组合，在37到42℃的恒定温度下进行20-30min的DNA扩增。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合启动DNA复制；重组酶从复合体释放后DNA聚合酶与引物结合促进新链合成；ssDNA结合蛋白可以使非模板链和置换链稳定，扩增产物以指数级增长。。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-35个碱基，扩增产物在300bp以内，目前基于RPA扩增产物进行检测的方法主要有三种形式:RPA与琼脂糖凝胶检测技术相结合(基础型RPA)、 RPA与荧光检测技术相结合(Real-time RPA)、RPA与侧向流动免疫技术相结合 (RPA-LFD)。基础型RPA不需要探针，但在扩增完成后需要对产物进行纯化，操作相对于其他两种检测方法较为复杂，RPA-LFD是利用荧光素标记的特异探针与生物素(Biotin)标记的核酸扩增产物特异性结合，将其滴加于试纸条上便会与胶体金标记的抗荧光素的抗体结合，但不能进行实时检测。Real-time RPA的对探针要求较高，探针长度46-52bp，同时标记荧光基团和相应的淬灭基团，标记为点在探针的中间或者两端，两基团中间同时引物THF酶切位点，探针的3` 端进行block。

研发一种简单、快速检测SVCV方法在诊断意义上具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测方法，能够简单、快速、低成本地检测出 SVCV。