[发明专利]一种低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法

说明书

本发明提供了一种低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法，所述的方法通过低速离心及超滤离心管进行浓缩后，再结合聚合物沉淀技术分离外泌体，仅需实验室常见的台式离心机及价格低廉的超滤离心管，操作方法简单易行，且不影响外泌体生物活性。本发明也有效解决了神经细胞较其它细胞分泌外泌体量少，分离富集难的问题。同时，由于含有外泌体的液体经过有效浓缩，使用的聚合物试剂大大减少，较之于现有技术，本发明的分离纯度与效率更高、可操作性强、可降低分离外泌体成本，具有良好的科学应用推广价值和应用前景。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种将低速离心机和超滤离心管相结合的外泌体分离方法，特别涉及一种低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法。

背景技术

外泌体作为一种细胞主动分泌到胞外的直径为30～100nm间的微小囊泡，是细胞间通讯的重要介质，在包括癌症、感染性疾病和神经变性疾病在内的疾病中，参与生物细胞之间的信号传递。临床上，外泌体可起到生物标志物，药物载体，解释疾病发生机制及显示干预新靶点等作用。神经细胞分泌的外泌体是神经细胞间交流的载体，在中枢神经系统疾病的发生、发展及损伤修复中起着重要的调控作用。而神经细胞由于分裂能力及代谢循环远低于肿瘤细胞，分泌体的分泌量远低于肿瘤细胞及躯体的其他细胞。因此如何富集及提取神经细胞外泌体也是一大挑战。

过滤离心是利用不同截留相对分子量(MWCO)的超滤膜离心分离外泌体。截留相对分子量是指能自由通过某种有孔材料的分子中最大分子的相对分子质量。外泌体是一个囊状小体，相对分子量大于一般蛋白质，因此选择一定大小的MWCO膜可以使外泌体与其他大分子物质分离。这种操作简单，仅需低速离心机就可实现，低速离心常指转速为8000r/min以下，相对离心力为10 000×g以下的离心。主要用于分离细胞、细胞碎片及培养基残渣等颗粒物。因此这步骤应用在提取外泌体方法中省时，不影响外泌体活性，可以作为进一步提纯使用。尽管超滤膜离心可以达到对稀溶液中的微量成分回收，但现有技术中的超滤膜离心也有一定的局限性，对于溶液分离的内容物，一般只能浓缩到10～50％的浓度。

目前分离外泌体最常用的方法主要有：超高速离心法、单纯聚合物沉淀法等。一般说，离心机转速在30 000r/min以上的称为超速离心。超高速离心法需要仪器特殊且昂贵，目前单单超高速离心机的购买费用达到10万元人民币以上，并且分离时常由于蛋白质参杂和外泌体破裂，分离出外泌体纯度不高，得不到普及应用。单纯聚合物沉淀法目前已有产品推出，但试剂使用量大，价格昂贵影响了进一步实验。而且，神经细胞由于分裂能力下降，较肿瘤细胞分泌的外泌体量少，使得分离富集更为困难。为此克服现有大部分实验室缺乏超高速离心机，仅有常规速度离心机，并且经费紧缺不能大量购买聚合物沉淀法试剂盒等不足，开发分离外泌体可操作性强、纯度高、经济实惠的方法，尤为急需。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中外泌体分离技术的缺点与不足，提供一种基于低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法，外泌体经低速离心及超滤离心管进行浓缩后，再结合聚合物沉淀技术进行分离。所述的方法可以应用于细胞外泌体，特别是神经细胞外泌体分离及提纯。本方法仅需实验室常见的台式离心机及价格低廉的超滤离心管，同时，由于本发明的含有外泌体的液体经过浓缩，使得聚合物试剂的用量大大减少，经多次提纯较以往方法，分离纯度更高、可操作性强、可降低分离外泌体成本等特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于低速超滤离心结合聚合物沉淀技术分离外泌体的方法，包括以下步骤：

(1)神经细胞培养48～72h后收集培养上清液，离心去除悬浮细胞后得到第一上清液，再次离心去除细胞碎片，得到第二上清液；

(2)通过0.22μm滤膜对第二上清液进行过滤，去除细菌和残留细胞器，得到外泌体初步滤液；