[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、确定靶基因的sgRNA序列；

S2、合成靶基因的sgRNA；

S3、在蜂卵的近头端腹侧显微注射编辑材料，以及进行注射卵的后期孵化；

S4、注射卵靶基因的PCR扩增；

以及S5、对步骤S4中获得的PCR扩增产物进行测序，以获得靶基因的基因编辑结果。

2.如权利要求1所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，所述靶基因为蜜蜂Mrjp1基因或Pax6基因。

3.如权利要求1所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，步骤S3中，所述编辑材料为靶基因的sgRNA与Cas 9蛋白的混合物，每ml编辑材料中含有180-220ng靶基因sgRNA以及180-220ng Cas 9蛋白。

4.如权利要求3所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，每ml编辑材料中含有200ng靶基因sgRNA以及200ng Cas 9蛋白。

5.如权利要求1所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，步骤S3包括：

S31、在蜜蜂的繁殖季节，将用于采集待注射卵的人工巢脾进行无卵化处理；将无卵化处理后的人工巢脾放置到蜂箱中，以让工蜂进行清理过夜，同时将蜂王与人工巢脾进行隔离；

S32、将蜂王关在人工巢脾的固定范围内排卵，且关王排卵时间为2-2.5小时，产卵后放出蜂王；

S33、显微镜下采用注射针在蜂卵的近头端腹侧完成编辑材料的注射，以获得注射卵，且每个卵在45-60s内完成注射全过程，且保证完成编辑材料注射后的卵处在1细胞期。

6.如权利要求5所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，步骤S33中，所述注射针为内径2-5μm、尖端带有刃的玻璃针。

7.如权利要求5所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，步骤S33中，当在蜂卵的近头端腹侧显微注射编辑材料时，所述注射针与卵的近头端腹侧的夹角小于30度，沿头侧向尾侧的方向进针，注射压600hPa，平衡压50hPa，且所述注射针进入卵内后，将编辑材料注入卵内的时间为0.1s。

8.如权利要求1所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，所述步骤S5中还包括：选取与注射卵相同孵化日龄的蜂卵，进行相同的靶基因的PCR扩增，并将该PCR产物测序后的结果作为注射卵靶基因编辑结果的空白对照。