[发明专利]一种用于构建同时实现基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的测序文库的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及用于构建DNA测序文库的方法和试剂盒。更具体地，本发明提供一种用于构建同时实现单细胞基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的DNA测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)裂解细胞以释放基因組DNA；2)使用由随机引物和特异性引物组成的混合引物对基因组DNA进行预扩增；和3)对预扩增之后的基因组DNA进行二次扩增，以获得所述DNA测序文库。本发明还涉及一种同时实现单细胞基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的方法和试剂盒。

技术领域

本发明涉及用于构建DNA测序文库的方法和试剂盒。更具体地，本发明涉及用于构建能同时实现单细胞基因组拷贝数变异检测和基因突变检测的DNA测序文库的方法和试剂盒。

背景技术

随着科技的进步，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对基因组测序，需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，高通量测序(也称第二代测序)技术应运而生。高通量测序技术的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq、NextSeq和Life Technologies/SOLID system、PGM、Proton等。到目前为止，Hiseq2000每个run可以达到6个人基因组30x覆盖的测序通量，约600G/run数据，在测序时间上Hiseq2500可以达到平均每8分钟读取一个碱基的速度。而且随着第二代测序技术的成熟，将其应用于临床的研究迅猛发展。

第二代测序技术在基因组拷贝数变异(Copy Number Variation,CNV)、插入缺失标记(Insertion/Deletion，InDel)、单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphisms，SNP)等检测领域的应用最为成熟。

CNV是指与基因组参考序列相比，基因组中大于等于1kb的DNA片段插入、缺失、倒位、易位和/或重复，及其互相组合衍生出的复杂的染色体结构变异，其具有分布范围广、可遗传、相对稳定和高度异质性等特点。研究表明，CNV是肿瘤发生发展的重要因素，其可通过影响原癌和抑癌基因的活性而诱发肿瘤。

InDel指的是在基因组的某个位置上所发生的小片段DNA序列的插入或者删除。Indel是人类基因组中除SNP外数量最多的变异形式，其中约三分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域如启动子区和外显子区。据报道，InDel在基因表型相关的研究中具有广泛用途，并在植物分子育种以及人类疾病诊断方面发挥重要的作用。

SNP是指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性，包括但碱基的转换、颠换、缺失和插入等形式。SNP在人类基因组的平均密度较高，可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素，并且遗传稳定性较高，因此作为一类遗传标记得以广泛应用。例如，SNP可用于确定基因多态性与疾病的关系，解释个体间的表型差异对疾病的易感程度，预测和诊断疾病，研究不同基因型个体对药物反应的差异，从而指导药物开发以及临床合理用药等。

然而，这三种变异类型，CNV、InDel和SNP对于测序的要求各不相同。具体而言，CNV一般为染色体水平的缺失或重复，因此CNV检测的关键是全基因组均匀覆盖，而对测序深度的要求不高(0.06x左右)。与此相反，对于InDel和SNP的检测，则要求目标区域达到一定的测序深度(至少20x)，而对基因组其他区域没有覆盖要求。在实践中，为了节约测序成本，一般根据不同变异类型对测序的要求而选用不同的检测策略。对于CNV检测，需采用全基因组DNA建库，低覆盖深度测序的方法来实现。而对于indel和SNP的检测，则需要对特异性扩增的目的片段进行建库，深度测序才能准确做出判断，从而达到检测目的。