[发明专利]一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法

说明书

本发明属于生物组织工程技术领域，公开了一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法，采用胶原酶分离法获得皮下和网膜组织来源的人脂肪间充质干细胞，原代培养至80％融合，再进行传代培养，并进行脂肪间充质干细胞的鉴定。选用生长良好的第三代细胞，加入无血清诱导培养基进行成脂、成骨诱导分化，最后进行油红O染色及茜素红染色鉴定分化效果及Real‑time RCR检测成脂、成骨基因表达情况。人脂肪组织易于获得，经原代培养所得的脂肪间充质干细胞足够存活量和存活期，且可诱导分化为成熟的成脂细胞和成骨细胞，为糖尿病、肥胖、骨质疏松症等代谢性疾病细胞治疗提供理想的种子细胞，为组织工程生物化骨、生物化脂肪提供新途径，有广阔的临床应用前景。

技术领域

本发明属于生物组织工程技术领域，尤其涉及一种人脂肪干细胞原代培养 及无血清多向诱导分化方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

人脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)诱导方式主要有体外诱导、基因修饰、蛋白转导与组织微环境诱导，其中体外诱导是采用不同刺 激因子组合，将干细胞诱导分化为目的细胞。文献报道的运用间充质干细胞体 外诱导分化为成脂、成骨细胞的研究报道非常多，主要有：1)均是由10％FBS 的DMEM作为基础培养基配制的成脂、成骨分化诱导液。2)分化时间较长， 大多在28天左右时间。其主要缺陷是：1)干细胞在含血清的培养基中分化为 成脂细胞，受干扰因素非常多、分化周期长；2)传统的化学试剂大多有毒性， 令人望而却步，影响后续临床应用；3)诱导后的成脂分化细胞低、状态不佳； 4)各实验室诱导分化条件各异，诱导分化机制尚不明确，且诱导分化效率低； 5)血清对于培养的原代细胞容易有支原体污染等，并且会影响干细胞的分化进 程。

无血清诱导分化液是在基础分化液的基础上，加入成分明确的血清替代物， 既能满足干细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。 因此，发展无血清分化技术是干细胞走向临床应用的重要条件。中国专利申请 201210197360.6公开了一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基，改培养基以高 糖型DMEM为基础培养基，添加了牛磺酸、还原性谷胱甘肽和铜蓝蛋白等组分， 但还原性谷胱甘肽是对高糖环境下的成骨细胞起到保护作用，对脂肪间充质干 细胞的成骨分化可起到促进作用，但对其成脂分化作用不大，存在细胞贴壁性 差，增殖缓慢，且该组分较复杂的缺陷。中国专利申请201310134502.9公开了 一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基，该培养基以低糖型DMEM为基础培养 基，虽然添加了碱性成纤维生长因子、肝素和谷氨酰胺等组分，但脂肪间充质 细胞由于取材等方面的影响，其生长增殖效果不够理想。中国专利申请 CN104762260A公开了一种脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途，该方 法获得的脂肪间充质干细胞纯度高达90％以上，其重点在于发现了能更好发挥 干细胞的功能，达到抗衰老目的，并未研究诱导分化的作用。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)细胞增殖速率不够理想，细胞组分复杂，原代细胞来源于脂肪组织， 除了我们所需的，间充质干细胞外，还含有成纤维细胞、前脂肪细胞及成熟的 脂肪细胞，成分复杂，而且增殖缓慢，达不到实验所需的细胞量。

(2)诱导分化时间长，细胞老化状态不好，分化液对细胞有毒性等。传统 分化需要28天，随着细胞老化及分化液对细胞的毒性，细胞状态不好，影响实 验结果。

(3)传统分化液含血清，血清中生长因子和细胞因子影响了代谢性疾病细 胞因子的检测，影响干细胞分化进程，导致研究误差大。

解决上述技术问题的意义：