[发明专利]一种评价公牛精子活力高低的长链非编码RNA组合及其检测方法和应用

说明书

本发明提供一种评价公牛精子活力高低的长链非编码RNA组合及其检测方法和应用，开发出用于评估公牛精子活力的lncRNA标记及分子检测和评价方法，所述方法包括：精液样品的采集与储存；RNA提取，文库构建和转录组测序；转录组组装；候选lncRNA的鉴定及差异表达分析；差异表达lncRNA的染色体定位；筛选用于评价公牛精子活力的功能性lncRNA组合；设计特异引物，建立lncRNA实时荧光定量PCR检测方法。本发明检测方法设计合理、方便，有效检测精液中影响精子活力的新分子标记—功能性lncRNA，这对于基于lncRNA的高繁殖力公牛的分子育种和公牛精液质量的分子评价技术的发展有着重要的意义和实用价值。

技术领域

本发明属于动物分子育种技术领域，具体涉及一种评价公牛精子活力的功能性lncRNA组合及其检测方法和应用。

背景技术

公牛繁殖力是影响奶牛遗传质量和经济效益的最重要因素，在现代奶牛的遗传改良中起着关键作用。近几十年来，由于人们过于关注对奶牛产奶量等性状的选育，忽视了对繁殖性状的选育。随着人工授精在奶牛繁殖中的大规模应用，评估精液质量显得尤为重要。精液质量常用几个指标来评估，例如射精量、精液密度、精子活力和畸形率。其中，精子活力是评估公牛精液质量的主要指标，也是决定鲜精能否生产冷冻精液主要指标。精子活力不足是公牛繁殖力低或者不育的关键原因之一（Guzick等， 2001）。由于精子活力差导致的精液生产失败，可引发严重的经济损失。

公牛精子活力是指在37℃环境下，前进运动精子占总精子数的百分率。种公牛精子活力的遗传力约为0.43（Druet等，2009），属于中等遗传力的性状，利用常规的育种技术选育高精子活力的公牛难度很大。国家标准《GB4143-2008牛冷冻精液》中，规定要求新鲜精液的精子活力≥65%，冻精解冻后的精子活力≥35%。在公牛的育种实践中最为突出的问题是，很难在公牛的早期对其精液品质进行评价和预测，因为精子活力高低需要在公牛性成熟后正常采精才能够判别，若发现精子活力低再淘汰，会造成很大的人力、物力损失。另外一个突出的问题是，尽管目前已经开发了相关的检测方法和评价指标来衡量精液质量，但是现有的对精液品质的评估技术基本上是基于表型评定，特别是精子活力的显微镜通用评价技术中，其检测的准确性和可靠性亟待改进。迄今，尚未有成熟的分子检测指标应用于公牛精子活力的评估。在一些全基因组关联研究中，已鉴定到和公牛精子活力相关的候选基因和单核苷酸多态性（SNP）(Qin 等，2016)。此外，高通量技术，包括转录组学和蛋白质组学，也揭示了高繁殖力和低繁殖力公牛精子之间的许多差异(Peddinti等， 2008)。然而，对于哪种调节机制影响公牛精子活力差异仍然知之甚少。我们在生产实际中发现，尽管全同胞的公牛具有相似的遗传背景，但公牛精子活力却存在很大的差异。因此，亟待了解影响公牛精子活力差异的潜在原因，鉴定出可评价精子活力的分子标记，对于揭示种公牛高繁殖力的分子机理具有重要的科学意义，对种公牛繁殖性能进行早期的遗传评估，以及对精液品质的进行预测和准确评价等具有很大的应用价值。

现有的RNA测序研究表明，一些长链非编码RNAs（lncRNAs）可能通过目前未知的机制调节睾丸发育和精子发生（Anguera等， 2011）。lncRNA是指长度大于200个核苷酸的非编码RNA，是转录和翻译过程中的关键调控因子。迄今尚未有关于影响公牛精子活力的功能性lncRNA的研究报道。本方案通过对具有不同精子活力的全同胞配对公牛的精液转录组进行高通量测序，获得了14种影响公牛精子活力的功能性lncRNAs，开发出可用于评估公牛精子活力高低的lncRNA标记，对基于lncRNA的高精子活力的种公牛遗传评估、早期选育、精液质量的分子评价技术等具有着重要的意义和实用价值。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种评价公牛精子活力的功能性lncRNA组合及其检测方法和应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

针对上述现有技术，本发明的目的在于提出了一种能够用于精子活力评估的功能lncRNA标记物组合，能够对公牛精子活力进行分子评价，填补公牛精液品质分子评价的空白。