[发明专利]一种高酶活的磷脂酶C突变体

说明书

本发明提供一种高酶活的磷脂酶C突变体，其序列如SEQ ID NO:7所示的多肽，或在SEQ ID NO:7所述的多肽中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：7所具备的磷脂酶C活性的由其衍生的多肽。本发明的磷脂酶C突变体能提高脱胶效率，增加脱胶过程中甘二酯(DAG)的得率。

技术领域

本发明涉及一种高酶活的磷脂酶C突变体。

背景技术

脱胶是油脂精炼的一个重要步骤，而传统的水化脱胶法经济成本高，物料能耗大，环境污染重，所以近些年，很多努力致力于将酶法脱胶用于油脂精炼中的脱胶环节，并取得了很大的进展。同传统方法相比,酶法脱胶能够提高经济效益，做到节能减排，对生态环境污染少，在环保、经济、质量等方面具有较大的优势。油脂脱胶所用的酶即为磷脂酶，并且同其他脱胶酶相比，磷脂酶C(PLC)表现出更大的优势，比如，增加甘二酯(DAG)的得率，以及减少得油量的损失。

Bacillus cereus的PC-PLC(BC-PC-PLC)是研究较早的一种磷脂酶C。BC-PC-PLC全长为283个氨基酸，其中包含24个氨基酸的信号肽和14个氨基酸的前导肽，成熟肽为245个氨基酸(Johansen et al.1988)。BC-PC-PLC的晶体结构已经被报道，其由多个螺旋结构域组成，催化位点为55位天冬氨酸，并且含有至少三个Zn2+结合位点(Hough et al.1989)。BC-PC-PLC的异源表达研究较少目前只在Bacillus subtilis和pichia pastoris中进行表达(Durban et al.2007；Seo et al.2004)。

在之前的研究中，发明人已经通过将BC-PC-PLC的四个氨基酸即56位，63位，131位和134位天冬酰胺分别突变为组氨酸，天冬氨酸，丝氨酸和天冬氨酸，比酶活相比于野生型大大提高。为了进一步提高该磷脂酶C的比酶活力和脱胶效率，发明人选择了BC-PC-PLC蛋白中第6位，第8位，第10位，第104位，第205位氨基酸进行随机饱和突变，对已有的磷脂酶C突变体进行定向进化，希望能够得到比酶活进一步提高的突变体，从而能够得到更高效的磷脂酶C，提高脱胶效率，增加脱胶过程中甘二酯(DAG)的得率。

发明内容

本发明提供一种分离的多肽，所述多肽选自：

(1)SEQ ID NO:7所示的多肽；和

(2)与SEQ ID NO:7至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性，对应于SEQ ID NO:7第6位、第8位、第10位和第104位中的至少1个位置的氨基酸残基分别相应地与SEQ ID NO:7第6位、第8位、第10位和/或第104位相同，同时保留SEQ ID NO：7所具备的磷脂酶C活性的多肽。

在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:7中，第6位氨基酸残基是脯氨酸或色氨酸；第8位氨基酸残基是丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；第10位和第104位氨基酸各自独立为丝氨酸或苏氨酸。

在一个或多个实施方案中，所述分离的多肽如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供一种分离的多肽，所述多肽与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性，且所述分离多肽在对应于SEQ ID NO:4第6、8、10和104位上的氨基酸残基分别是脯氨酸、缬氨酸、丝氨酸和丝氨酸；优选的，所述多肽获自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

本发明还提供一种多核苷酸序列，选自：

(1)编码本文任一实施方案所述多肽的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；和