[发明专利]一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗，其特征在于，制备所述疫苗的产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列第176位组氨酸突变为天冬酰胺，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种分泌产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的大肠杆菌菌株的构建方法，所述产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生突变，其特征在于，包括以下步骤：

1）根据GeneBank上公布的α毒素基因序列AY823400.1设计引物，以A型产气荚膜梭菌DNA为模板，进行PCR扩增；

2）PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收目的片段，回收的目的片段送公司测序，获得α毒素基因序列；

3）根据α毒素测序结果，对α毒素的第176位组氨酸（CAT）突变为天冬酰胺（AAT），同时对信号肽序列进行密码子优化，优化得到的序列如SEQ ID NO:2所示；将化学合成的该序列插入到载体pET32a的EcoR I和 Xho I酶切位点之间，获得重组质粒pET32a-αH176N；

4）将重组质粒pET32a-α H176N转化BL21（DE3）感受态细胞并进行培养，PCR鉴定阳性的大肠杆菌菌株即为分泌产气荚膜梭菌α毒素蛋白的大肠杆菌菌株。

3.一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，制备所述疫苗的产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白与野生型α毒素蛋白相比，其氨基酸序列发生突变，其特征在于，包括以下步骤：

1）根据权利要求2所述的方法构建分泌产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的大肠杆菌菌株；

2）对分泌产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的大肠杆菌进行自诱导发酵培养；

3）对发酵培养后的大肠杆菌进行离心，收集培养基，培养基经0.22μm孔径滤膜过滤，收集滤液；

4）将收集的滤液与佐剂混匀，制备产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗。

4.根据权利要求3所述的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，其特征在于：发酵培养的培养基包括自诱导培养基和消泡剂。

5.根据权利要求3所述的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，其特征在于：在步骤4）之前对滤液进行无菌检验。

6.根据权利要求3所述的产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的制备方法，其特征在于：在步骤4）之前测定所述滤液的毒性，其包括步骤：卵磷脂酶活性试验和小鼠毒力试验。