[发明专利]检测UMPS基因rs1801019位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测UMPS基因rs1801019位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒。本发明采用UMPS基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增UMPS基因片段，同时在UMPS基因特异性的引物界定的扩增区域内设计UMPS基因特异性人工模拟核酸分子信标SEQ3‑FAM和SEQ4‑VIC。本发明提供的基于基因特异性PCR结合人工模拟核酸分子信标判断UMPS基因rs1801019位点多态性的方法不仅准确率高，而且还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点，非常适合于在临床中大规模开展。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及UMPS基因rs1801019位点多态性的分型检测方法与试剂盒。

背景技术

胃癌是一种由胃黏膜而患上的癌症。其早期特征可能包括胃灼热、上腹痛、恶心和食欲不振。之后的症状和体征可能包括体重减轻、皮肤白浊、呕吐、吞咽困难和便血等。胃部癌症亦可扩散至身体其它部位，特别是肝脏、肺部、骨骼和淋巴结。在全球范围内，胃癌是造成癌症的第五大原因，也是因癌症死亡的第三大原因。随着食品低温保鲜技术的发展以及饮食结构的优化，胃癌的发病率有所下降。

胃癌最常见的原因是幽门螺杆菌感染，占病例总数60%以上。而吸烟、饮食（如腌制蔬菜）和肥胖则是其它的风险因素。约有10%的胃癌发病具有家族性特征，因此除了饮食因素和环境因素之外，与胃癌相关基因的遗传多态性决定了胃癌的易感性。

尿苷一磷酸合成酶（UMPS）催化嘧啶从头合成途径的最后两个步骤，最终将乳清酸转化为尿苷一磷酸。UMPS基因中的单核苷酸多态性位点rs1801019（C/G）可通过影响药物和嘧啶代谢从而改变胃癌的易感性。因此，对该位点进行分型检测对胃癌的预防具有重要意义。

目前，基因多态性检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、高分辨率溶解曲线法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测基因多态性，但都有不可忽视的局限性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。高分辨率溶解曲线法对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在困难。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻底，存在背景荧光信号。此外，Taqman探针对于单碱基错配识别能力较差，极易生成非特异荧光信号，干扰结果判读，进而影响检测的准确性。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵敏度高、准确可靠的检测基因多态性的方法。

分子信标（Molecular Beacon）在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成，环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团（F），3′端标记淬灭基团（Q）。对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与淬灭基团靠近（约为7-10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和淬灭基团距离增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后分子信标的荧光几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比（图1）。因此，理想的分子信标比Taqman水解探针更为高效。然而，由于分子信标中与靶序列无关的茎杆区的引入导致分子信标与模板序列之间常会产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变（包括单碱基的错配、缺失或插入突变）效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会导致环状区序列过长，从而影响检测效率。因此，得到一个理想的分子信标往往比较困难。