[发明专利]一种利用联合法从胎盘绒毛膜中提取间充质干细胞的方法

说明书

本发明公开了一种利用联合法从胎盘绒毛膜中提取间充质干细胞的方法，包括胎盘预处理后，将胎盘绒毛膜组织通过部分消化法进行初步分解，再利用部分消化后的松散产物通过组织接种的方式，通过培养制备得到胎盘多能干细胞的步骤；然后再将原代细胞进行传代培养并收集的步骤；最后进行程序降温冻存，将温度降至‑80℃后取出样本，转移至液氮罐中长期保存，优点是快速收获较多的均一、稳定的原代细胞，并能够持续传代，不仅具有较高的克隆形成能力，还能够稳定的表达胎盘间充质表面标记。

技术领域

本发明涉及细胞分离提取领域，具体涉及一种利用联合法从胎盘绒毛膜中提取间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，在胚胎发育中来源于中胚层，之后几乎分布于机体的所有器官与组织中；MSCs具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，如骨、软骨、肌腱、脂肪、肝、肾、皮肤、肌肉、神经甚至胰腺等，因而成为再生医学中器官修复等领域的理想种子细胞。

间充质干细胞具有广阔的临床应用前景，其有三个主要来源：骨髓、脂肪组织、胎盘，其中，以胎盘中存量最多，也最接近胚胎干细胞；一直以来由于对胎盘干细胞知识缺乏了解，使得胎盘分娩后便当做医疗废物丢弃，若充分利用这些干细胞资源，便能够造福于万千家庭、造福于社会；

近年来，随着对胎盘研究的深入，不仅充分认识并利用了脐带血，也充分认识了胎盘类干细胞在医学上的重要作用，胎盘中不仅含有丰富的造血干资源，也含有丰富的间充质干细胞；

胎盘是母体与胎儿间营养交换的通道，也形成胎盘屏障；母体面以底蜕膜将母体与胎儿分开，胎儿面则以羊膜与胎儿隔离开，并通过脐带连通胎儿，为胎儿提供营养；

胎盘绒毛膜构成胎盘的胎儿部分，是胎盘的主要部分，其中含有丰富的间充质干细胞资源，目前，胎盘间充质干细胞的提取主要有组织团法、消化法两种，但两者各有弊端：组织团法不能将组织块内部的细胞爬出，造成培养成功率低、形态较差且收获率低；消化法则存在过度消化，破坏细胞的正常状态，严重影响细胞的活性；因此亟待需要有新的有效的胎盘干细胞提取方法。

发明内容

为了解决现有充质干细胞提取收获效率低、活性差等问题，本发明提供了一种利用联合法从胎盘绒毛膜中提取间充质干细胞的方法，将组织块部分消化内部松散之后再贴壁培养，具体包括以下步骤：

步骤一、选取胎盘，并对胎盘进行检测，确保其全阴性；剪取胎盘上新鲜的绒毛膜样品组织；

步骤二、将剪取获得的样品组织置于磷酸缓冲盐溶液中进行清洗；

步骤三、挑取颜色鲜艳的清洗好的样品组织，去除可见大血管、残余胎盘隔组织，再将样品组织剪成样品组织碎片；

步骤四、在样品组织碎片中加入消化液，并进行摇晃消化；待消化进行到30％-70％时，再通过培养液终止，获得其中松散的组织块；

步骤五、将松散组织块平铺接种于培养容器中，静置；

步骤六、待培养容器中的组织块的周围干燥后，加入培养液，以使得组织块与培养液充分接触，再将其放入到培养箱中进行培养；

步骤七、待组织块周围细胞形成密集集落时，进行传代；

步骤八、传代培养完成后，采用磷酸缓冲盐溶液进行清洗，再用重组消化酶或胰酶消化后，待细胞变圆、脱落，停止消化，终止后收集细胞悬液；将细胞悬液去上清，将细胞沉淀重悬，按每皿不低于2.0×105个细胞接种于平皿中；

步骤九、待细胞长至80-90％密度时，获得间充质干细胞，进行冻存。

较佳地，步骤一中选取好的胎盘需经过乙肝、丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨细胞病毒的检测，确保全阴性。