[发明专利]在亲和层析纯化中减少抗体多聚的方法

说明书

本发明公开一种在亲和层析纯化中减少抗体多聚的方法，是以含0.1～1.0M精氨酸的洗脱缓冲液进行洗脱。本发明通过在洗脱液中加入精氨酸可以抑制亲和层析时抗体多聚的产生，且不会干扰抗体结构并维持单体状态，减少样品的多聚峰，增加样品的主峰，增加回收率。精氨酸会抑制多聚来稳定蛋白质，但不会使蛋白变性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及亲和层析纯化中减少抗体多聚的方法。

背景技术

近年来，肿瘤治疗领域迅速发展，抗体已成为生物制药行业的关键治疗手段之一。至今，有超过100个双特异性抗体药物正在处于研究阶段，其中大多数都处于临床前和临床Ⅰ期阶段。Protein A/G在抗体的亲和纯化中得到了广泛应用，Protein A在中性pH下与抗体结合，这种特异性的结合不能通过简单的离子强度去洗脱，需要用较低的pH(2.5-3.5)去洗脱。而在较低的pH洗脱条件就会造成抗体的构象发生变化，从而导致抗体发生聚集或降解，降低纯化效率。

精氨酸是一种两性氨基酸，化学式C₆H₁₄N₄O₂，pKa值分别为2.17、9.04和12.48。通常用于蛋白质的生物合成。与主链最接近的侧链部分较长、有机且疏水，另一端的侧链是一个胍基，在中性或酸性或碱性的环境下都带正电，具有高度极性。精氨酸是蛋白质再折叠常用的添加剂之一，具有稳定蛋白、增加变性蛋白的溶解性、阻止蛋白再折叠等特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种在亲和层析纯化中减少抗体多聚的方法，能提高纯化后样品的纯度。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种在亲和层析纯化中减少抗体多聚的方法，以含0.1～1.0M精氨酸(Arginine)的洗脱缓冲液进行洗脱。

具体的，所述精氨酸的浓度可以为0.1M，0.2M，0.3M，0.4M，0.5M，0.6M，0.7M，0.8M，0.9M，或1.0M。

优选的，所述精氨酸浓度为0.1～0.5M；更优选的，所述精氨酸浓度为0.2～0.4M；最优选的，所述精氨酸浓度为0.2M。

具体的，所述洗脱缓冲液含0.05～1.0M甘氨酸(Glycine)、0.1～1.0M精氨酸且pH≥3.5且pH为酸性。其中，甘氨酸浓度可以为0.05M，0.1M，0.15M，0.2M，0.25M，0.3M，0.35M，0.4M，0.45M，0.5M，0.55M，0.6M，0.65M，0.7M，0.75M，0.8M，0.85M，0.9M，0.95M，或1.0M。所述精氨酸的浓度可以为0.1M，0.2M，0.3M，0.4M，0.5M，0.6M，0.7M，0.8M，0.9M，或1.0M。

优选的，所述洗脱缓冲液含0.05～0.5M甘氨酸、0.1～0.5M精氨酸且pH≥3.5且pH为酸性；更优选的，所述洗脱缓冲液含0.1～0.3M甘氨酸、0.2～0.3M精氨酸且pH≥3.5且pH≤4.0；最优选的，所述洗脱缓冲液含0.1M甘氨酸、0.2M精氨酸且pH＝3.5；

具体的，在洗脱之前，先用平衡2缓冲液进行层析柱平衡，所述平衡2缓冲液为0.1MTris-HCl溶液，pH 7.0。

具体的，在平衡2之前，先用冲洗缓冲液进行层析柱冲洗，所述冲洗缓冲液为600mM精氨酸溶液，pH 8.0。

具体的，在冲洗之前，先用平衡1缓冲液进行层析柱平衡，所述平衡1缓冲液为0.1MTris-HCl溶液，pH 7.0。

具体的，在洗脱之后，用清洁缓冲液进行层析柱清洁，所述清洁缓冲液为100mM磷酸溶液。

具体的，在清洁之后，用平衡3缓冲液进行层析柱平衡，所述平衡3缓冲液为0.1MTris-HCl溶液，pH 7.0。