[发明专利]一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法及其应用，1)分别克隆促溶标签GST基因、促溶标签His6‑SUMO基因和PVC3‑ORF2基因；2)将获得的3种基因连接，获得融合基因；3)将获得的融合基因与大肠杆菌表达载体连接，得到含融合基因的重组表达载体；4)将获得重组表达载体转化入大肠杆菌表达菌株感受态细胞中，获得包含融合基因的重组大肠杆菌表达菌株；5)将获得的重组表达菌株进行培养，利用IPTG诱导融合蛋白表达；6)将培养获得的重组表达菌体回收、破碎并分离纯化得猪圆环病毒3型ORF2蛋白；不但获得表达量较高的可溶性蛋白，且达到了较高的免疫还原性。

技术领域

本发明涉及一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是圆环病毒属的代表种，是一种共价闭合、单股环状DNA病毒，而且是迄今发现最小的动物病毒。2015年以前，全球范围内仅发现猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)两个型。2015年6月，美国北卡罗来纳州某商品化猪场暴发PDNS疫情，与以往相比，该次疫情更为严重。PaLinski等借助新一代测序技术(NGS)从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定出一种新型病毒，该病毒符合国际病毒分类委员会(ICTV)圆环病毒分类标准，因此命名为猪圆环病毒3型(PCV3)。

PCV3与PCV1和PCV2一样，病毒粒子呈二十面体结构，其基因组为单股DNA，全长2000bp，包含3个主要开放阅读框(ORF)，其中ORF2全长642bp，编码由214个氨基酸组成的衣壳蛋白(Cap)。Cap蛋白为PCV的主要结构蛋白，诱导动物机体产生特异性免疫应答。PCV3在细胞上的增殖滴度很低，很难应用传统的灭活疫苗和弱毒疫苗。新型的疫苗如DNA疫苗，免疫效率并不高；而亚单位疫苗比DNA疫苗有更好的免疫力。

猪圆环病毒3型ORF2蛋白亚单位疫苗已有关于使用原核表达ORF2截短蛋白的报道，但原核表达常以包涵体形式存在，涉及到变性、复性等操作繁琐步骤和成本高等不利因素，而杆状病毒则有表达成本高，蛋白纯化困难等缺点。

发明内容

为了解决现有技术手段的不足，本发明提供一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法，不但获得表达量较高的可溶性蛋白，且达到了较高的免疫还原性。

本发明所采用的技术方案是这样的，一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法，包括以下步骤：

1)分别克隆促溶标签GST基因、促溶标签His6-SUMO基因和PVC3-ORF2基因，其中，所述的PVC3-ORF2基因包含序列表中SEQ ID NO:2序列；

2)将步骤1)获得的3种基因连接，获得融合基因GST-His6-SUMO-PVC3-ORF2，该融合基因包含序列表中SEQ ID NO:3序列；

3)将步骤2)获得的融合基因与大肠杆菌表达载体连接，得到含融合基因的重组表达载体；

4)将步骤3)获得重组表达载体转化入大肠杆菌表达菌株感受态细胞中，获得包含融合基因的重组大肠杆菌表达菌株；

5)将步骤4)获得的重组大肠杆菌表达菌株进行培养，利用IPTG诱导融合蛋白表达；

6)将步骤5)培养获得的重组大肠杆菌表达菌体破碎并分离纯化得猪圆环病毒3型ORF2蛋白。

优选地，所述的步骤3)中大肠杆菌表达载体为pET28a。

优选地，步骤4)所述大肠杆菌表达菌株为BL21(DE3)。