[发明专利]一种双光子比率荧光探针在检测β-半乳糖苷酶中的应用

说明书

本发明公开了一种双光子比率型荧光探针精确测量肿瘤细胞中的β‑半乳糖苷酶的制备方法和应用。该探针基于荧光共振能量转移的双光子萘衍生物骨架与对甲氨基酚荧光团连接，加上β‑半乳糖苷酶可活化单元构成。利用酶促反应切割保护基团以产生游离酚，导致荧光发射信号比例性的变化。优势在于，能量供体与受体之间的荧光光谱距离更大，光谱之间的干扰更小，灵敏度更高。为临床用于检测活体内原发性卵巢癌的重要标志酶提供了潜在工具。

技术领域

本发明涉及小分子荧光探针鉴定异常的生物酶活性在癌细胞中的位置和表达水平，更具体地说是一种基于荧光共振能量转移的双光子萘衍生物荧光探针对原发性卵巢癌的重要标志物β-半乳糖苷酶（β-gal）的检测。

背景技术

当前，癌症一经发现基本都被判为晚期。在与癌症相关的死亡中，如果可以早期诊断，大约30％的人已经得救。癌症和癌症靶向治疗的早期准确诊断对于增加治愈的机会和提高癌症存活率具有重要意义。特别地，癌症相关生物标志物的临床测量对于癌症诊断，治疗和管理具有重要意义。在许多潜在的生物标志物中，酶在许多生理学、病理学和药理学过程中的重要作用受到了强烈关注。许多研究表明，某些酶的异常活性与各种癌症直接相关。典型的β-半乳糖苷酶（β-gal）在原发性卵巢癌中的酶活性明显增强。因此，鉴定生物标志酶在活癌细胞中的位置和表达水平成为早期癌症的诊断和监测治疗的关键，也是当前该研究领域亟需解决的问题之一。

目前已经应用了几种成像技术来检测或成像酶，例如磁共振成像（MRI），核成像（包括单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET））以及荧光成像。每一种技术都是不可替代的，具有自己的特征灵敏度，深度穿透和空间分辨率。例如，MRI对活癌细胞中低丰度的酶缺乏足够的特异性和敏感性。 SPECT和PET具有高灵敏度和断层扫描能力，但空间分辨率较差（1-2 mm）。其他一些检测方法，如使用标记抗体或蛋白质组学方法，可用于检测和跟踪固定细胞中的酶或在体外进行检测，但未能提供活细胞中酶的实时信息。为了克服这些缺点，基于小分子荧光探针的荧光成像已被广泛用于可视化和量化活细胞动态过程中，其具有高灵敏度，非破坏性快速分析和实时检测的优势。

大多数小分子酶荧光探针是基于与酶活性位点的特异性相互作用而设计的，包括催化位点和结合位点。酶具有区分各种底物之间微小差异和催化底物特异性反应的能力，通过将最佳底物基团连接到荧光团来产生基于底物的探针，荧光团在活性酶转化时其光谱性质相应改变。在基于FRET的探针中，荧光团和底物通过酶可切割的接头在一定距离内彼此连接，以产生比率型探针，其在底物通过特异性酶促反应释放后恢复荧光。总之，理想的小分子酶探针在靶酶催化的化学修饰后应经历可检测的荧光变化，本文中，设计并合成了一种新的双光子有效比率荧光化合物（TPR-βgal），用于检测生物系统中β-半乳糖苷酶（β-gal）的活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题：一是提供一种原料廉价易得，合成步骤简单，反应条件温和的荧光探针合成方法。二是提供了一种具有大斯托克斯位移、检测速度快、选择性强、高特异性、灵敏度高、低细胞毒性，检测生物样品、活细胞和动物中的β-gal的新型比率双光子荧光探针。

为了解决上述技术问题，采取的技术方案如下，一种特异性识别β-gal的比率双光子荧光探针，具有如下分子结构式：

上述β-半乳糖苷酶荧光探针的制备方法如下：

1）将1 eq的Np-Rhod染料与1.25 eq碘化钠，溶解于 N, N-二甲基甲酰胺中，然后向混合液中加入0.6 eq的2,3,4,6-四乙酰氧基-alpha-D-吡喃糖溴化物，室温下搅拌4h, 后升温至80℃回流12h。用TCL板监测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压蒸发，并用硅胶柱进行分离，得到化合物TPR-βgalAc，其结构式如下：