[发明专利]一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc及其构建方法和应用

说明书

一种人原代骨肉瘤细胞株NEO217‑luc及其构建方法和应用，所述细胞株NEO217‑luc保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2018179。该细胞株NEO217‑luc的细胞有重叠生长的能力，细胞异型性明显，具有骨肉瘤细胞的形态特征，是一株新建的人骨肉瘤肿瘤细胞系，可在培养基中进行体外培养，且体外培养生长快速稳定、能连续传代，进而方便建立骨肉瘤免疫缺陷小鼠体外模型；免疫缺陷鼠皮下成瘤性好，且肿瘤随着时间的延长生长迅速且浸润性强，为药物的体内试验提供了重要的保证，可作为骨肉瘤发病机制及个体化治疗体外研究的细胞材料，可应用于制备、筛选、评价抗脊柱骨肉瘤药物。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc及其构建方法和应用。

背景技术

骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤之一。然而脊柱骨肉瘤非常罕见，患病率仅占所有原发性骨肉瘤的3％。虽然骨肿瘤外科医生建议对任何原发性骨肉瘤进行大范围的切除术，但是与四肢骨肉瘤相比，脊柱骨肉瘤的预后较差。在过去的几十年里，已经有一些关于人骨肉瘤细胞系建立的报道。然而很少有人建立脊柱骨肉瘤细胞系，这使得研究脊柱骨肉瘤的生物学行为变得困难。因此，建立脊柱骨肉瘤细胞系作为临床相关的脊柱骨肉瘤模型来研究其生物学行为具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的目的在于提供来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc及其构建方法和应用，该种新型人原代骨肉瘤细胞株，为研究病人体内骨肉瘤的发生、耐药机制及治疗提供良好的体外模型，进而促进脊柱骨肉瘤的基础研究、预防及临床诊治。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc，该细胞株NEO217-luc保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏日：2018.10.24，保藏号为CCTCC NO：C2018179。

本发明还提供了所述人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc的构建方法，其包括如下步骤：

1)将脊柱骨肉瘤患者手术切除后的无菌新鲜肿瘤标本用Hanks液反复冲洗，去除标本表面粘附的红细胞，用无菌组织剪将标本反复剪切至糜状，移入装有10ml DMEM培养基的无菌离心管中，加入II型胶原酶10μl，同时加入青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)，放入恒温振荡仪中在37℃下以200次/min的速度进行振荡，振荡2小时候后取出、用巴氏吸管将其吹打混匀，将组织悬液用400目无菌金属筛网中过筛，收集过筛后的液体，用巴氏吸管紧贴离心管将收集的液体缓慢加入到预盛5ml Ficoll淋巴细胞分离液的无菌离心管中，放入离心机中2500转/min、离心30min；离心完毕后取出，将中间的细胞层用吸管小心吸出置入另一离心管中，5mLPBS对吸出的细胞层吹打、重悬，再次离心，去上清后底部即为分离所得的组织细胞；

2)将步骤1)处理获得的组织细胞接种于细胞培养瓶中，加入含有20％胎牛血清、青霉素(100U/mL)、链霉素(100mg/mL)的DMEM培养基，将细胞培养瓶放置在温度设定为37℃、CO₂浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；培养第3天进行半量换液一次，第5天进行全量换液一次，第7天用含有0.02％EDTA的0.25％胰酶将贴壁细胞消化后进行1：2传代；

3)将传代的细胞接种于新的细胞培养瓶中，加入含有10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)的DMEM培养基进行培养；在培养的过程中，挑选不同代数的细胞进行冻存保种，收集细胞后将细胞用冻存液重悬，将冻存管放入液氮罐中保存，将该细胞系命名为NEO217。