[发明专利]用于检测艰难梭菌基因的引物组合物、试剂盒及试剂盒的应用

说明书

本发明公开了一种用于检测艰难梭菌基因的引物组合物、试剂盒及试剂盒的应用，其中引物组合物为用于检测gluD基因的引物组合物、用于检测tcdA基因的引物组合物、用于检测tcdB基因的引物组合物、用于检测cdtA基因的引物组合物和用于检测cdtB基因的引物组合物中的一种或多种；试剂盒包括上述的引物组合物、dNTP、聚合酶、反应缓冲液、荧光试剂。本发明的引物组合物根据艰难梭菌几种保守基因序列所设计，能更准确的判断是否为艰难梭菌以及确定产毒艰难梭菌的毒素类型，可应用于艰难梭菌的LAMP检测，具有灵敏性高，特异性强等优势。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及用于检测艰难梭菌基因的引物组合物、试剂盒及试剂盒的应用。

背景技术

艰难梭菌(Clostridium difficile,C.difficile)是一种严格厌氧生长的革兰阳性梭状芽孢杆菌，为人类肠道中的正常菌群。是一种机会致病菌，生存环境恶劣情况下可以形成次极端芽孢的专性厌氧菌。大量应用广谱抗生素等原因造成肠道稳态失衡,该菌过度繁殖，引起CDAD(艰难梭菌相关性腹泻)。艰难梭菌(Clostridium difficile)属厌氧性细菌，是引起院内肠道感染的主要致病菌之一。临床上，约15％～25％的抗菌药物相关性腹泻，50％～75％的抗菌药物相关性结肠炎和95％～100％的伪膜性肠炎是由CDI(艰难梭菌感染)引起。CDI主要是由于长期或不规范使用抗菌药物而导致肠道菌群紊乱而最终产毒艰难梭菌在人类肠道过度繁殖引起。主要临床症状为发热、腹痛以及水样便腹泻。轻者引起腹泻，严重者引起伪膜性肠炎，且常伴有中毒性巨结肠、肠穿孔、感染性休克等并发症，甚至最终导致死亡。在美国和欧洲，CDI已成为相关性腹泻的首要病因，总体发病率高于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染，而在中国CDI潜在威胁远高于国际水平，临床需求较明确。

艰难梭菌可分为产毒株和不产毒株，不产毒株不引起临床症状。艰难梭菌产毒株的产毒因子主要包括毒素A和毒素B，由tcdA和tcdB编码，而tcdA和tcdB受负向调节基因tcdC、正向调节基因tcdD以及膜孔蛋白基因tcdE调节，以上基因共同构成了致病决定区。毒素A又称肠毒素，易导致回肠肠壁中性粒细胞浸润，释放淋巴因子，引起液体大量分泌和出血性坏死；毒素B又称细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架，导致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞。此外，在北美洲和欧洲引起广泛暴发流行的027型艰难梭菌可以产生更强的毒素，即二元毒素(binarytoxin，CDT)。CDT由CDT a和CDT b这两种独立蛋白链组成，由致病性决定区外的2个染色体基因cdt A基因和cdt B基因编码。cdtA是一种ADP核糖转移酶，可阻断肌动蛋白片段的合成而诱导细胞死亡，cdtB是一种运输蛋白，被丝氨酸蛋白酶激活后，cdtB通过与宿主细胞结合，把cdtA转移至细胞液中，诱导细胞骨架解聚，生成微管突出物，增强艰难梭菌的定植。

目前对于艰难梭菌的检测的主要对象是细菌、毒素、毒素基因、乳酸脱氢酶。目前国际公认鉴定艰难梭菌的“金标准”仍然是传统的粪便标本培养和细胞毒素实验，但周转时间长、操作难、设备技术要求高。目前并未常规应用于临床微生物实验室；GDH(谷氨酸脱氢酶)是所有艰难梭菌高水平表达的代谢酶(艰难梭菌中GDH抗原由gluD基因编码)，可用于筛查疑似艰难梭菌患者粪便样本，能够通过EIAs(酶联免疫法)直接检测粪便中的GDH抗原，操作简单、快速且敏感度高，但是由于不能区分产毒和非产毒艰难梭菌而只能作为一种高度敏感的初筛手段；EIAs直接检测粪便中的艰难梭菌毒素，通过单克隆抗体特异性结合艰难梭菌A/B毒素蛋白进行检测，特异性高，能区分产毒和非产毒艰难梭菌，且检测周期短，数小时能出结果，操作简便、应用广泛，但是敏感性较低(39％～76％)，因此常和GDH检测或核酸扩增技术联合应用，用于艰难梭菌感染实验室两步法或三步法诊断。PCR法检测CDI具有快速、准确、可定量等优势，其中TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、复合探针、染料及分子信标等方法目前已成功应用到病原菌分子诊断领域，但是同时面对的一个问题是价格比较贵，检测成本比较高，临床推广有一定难度。因此，开发一种快速、特异、灵敏且成本相对更低的艰难梭菌毒素基因检测方法意义重大。