[发明专利]鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株及其构建方法

权利要求书

1.鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；

(2)以pEPkan-S为模板，以1603F、1603R作为引物，通过PCR方法扩增包含I-SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上、下游各40bp同源臂的打靶片段1603，切胶回收获得1603片段；

1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’；

1603R:5’-AGGTTAATACGCGCTTGCAGCATATATCGCGACAGGTTTAGTCTATCGCAGTTCTGTAAACGAGAGCCTTTTATATATTGttaaccaattctgattag-3’；

(3)将1603片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana；

(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana中的I_sceI-Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1，然后制备GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1感受态；

(5)以pEPkan-S为模板，以1808F、1808R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_sceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上下游各40bp的内部同源打靶片段1808，切胶回收获得1808片段；

1808F:5’-ATGGCGACGGCATCGCGACGGCCAAGCGGTCAAGCGTGCGaggatgacgacgataagtaggg-3’；

1808R:5’-TTAACTCTTGGGGCGTTTTGTGGTACCCGCGAGTGCGCTCACGCACGCTTGACCGCTTGGCCGTCGCGATGCCGTCGCCATttaaccaattctgattag-3’；

(6)将1808片段转化到GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1感受态中，经筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1-Kana；

(7)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1-Kana中的I_sceI-Kana片段去掉，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1；

(8)从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1中提取pBAC-DPV-2ΔUS1质粒，将pBAC-DPV-2ΔUS1质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1。

2.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1的构建方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增体系为：ddH₂O 7μL、Max DNAPolymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。

3.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1的构建方法，其特征在于，步骤(5)中PCR扩增体系为：ddH₂O 7μL、Max DNAPolymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。