[发明专利]鸭瘟病毒gI基因无痕缺失株DPV CHv-ΔgI及其构建方法

权利要求书

1.鸭瘟病毒gI基因无痕缺失株DPV CHv-ΔgI的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；

(2)以pEPkan-S为模板，以GS1783-BAC-ΔgI-F和GS1783-BAC-ΔgI-R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及gI基因上游和下游各40bp同源臂的打靶片段I_SceI-Kana-gI，切胶回收获得I_SceI-Kana-gI片段；

(3)将I_SceI-Kana-gI片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gI-Kana；

(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gI-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，制备GS1783-pBAC-DPV-ΔgI感受态；

(5)以pEPkan-S为模板，以GS1783-MiniF-F和GS1783-MiniF-R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段、位于MiniF元件ori2基因下游240bp处和位于MiniF元件ori2基因下游290bp处的同源臂片段I_SceI-Kana-MiniF，切胶回收获得I_SceI-Kana-MiniF片段；

引物序列为：

GS1783-MiniF-F:5’-TTATTAATCTCAGGAGCCTGTGTAGCGTTTATAGGAAGTAGTGTTCTGTCATGATGCCTGCAAGCGGTAACGAAAACGATtgttacaaccaattaacc-3’；

GS1783-MiniF-R:5’-ATCGTTTTCGTTACCGCTTGCAGGCATCATGACAGAACACTACTTCCTATtagggataacagggtaatcgat-3’；

PCR扩增体系为：ddH₂O 22μl、Max DNA Polymerase 25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板1μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min；

(6)以CHv基因组为模板，以CHv-UL23-F和CHv-UL23-R作为引物，通过PCR方法扩增包含UL23基因、I_SceI-Kana-MiniF下游同源臂重叠25bp和位于MiniF元件ori2基因下游180bp处的同源臂片段，切胶回收获得UL23-MiniF片段；

(7)以I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段为模板，进行PCR融合反应，然后以融合片段为模板，以GS1783-MiniF-F和CHv-UL23-R作为引物进行PCR扩增获得I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段；

(8)将I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段转化到GS1783-pBAC-DPV-ΔgI感受态中，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔgI-UL23-Kana；

(9)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔgI-UL23-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔgI-UL23；

(10)从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔgI-UL23中提取pBAC-DPV-ΔgI-UL23质粒，将pBAC-DPV-ΔgI-UL23质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得gI基因无痕缺失株DPV CHv-ΔgI。

2.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒gI基因无痕缺失株DPV CHv-ΔgI的构建方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(6)中PCR扩增体系为：ddH₂O 22μl、Max DNAPolymerase 25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板1μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min。