[发明专利]鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPV CHv-ΔLorf5及其构建方法

说明书

本发明提供了一种鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPV CHv‑ΔLorf5及其构建方法。本发明利用GS1783大肠杆菌菌株及pEPkan‑S质粒，在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上经两次同源重组缺失鸭瘟病毒Lorf5基因，再经过细胞内自发同源重组方法缺失MiniF元件，首次完成了无外源碱基和MiniF元件残留的鸭瘟病毒无痕缺失株的构建。本发明技术方案解决了缺失鸭瘟病毒基因时在缺失位点残留碱基的问题并缺失了MiniF元件，为准确探究鸭瘟病毒基因功能及减毒活疫苗的构建提供了充分的技术支持。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鸭瘟病毒Lorf5基因无痕缺失株DPVCHv-ΔLorf5及其构建方法。

背景技术

细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)是一种新发展起来的DNA载体系统，它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点，在基因文库构建和基因功能分析等方面有广泛的应用。将完整病毒基因组DNA分子插入BAC载体，利用该载体编码的最小生育力因子复制子(Minimal fertility factor replicon，Mini-F)获得分子克隆化病毒，并结合大肠杆菌中成熟的基因定位修饰技术，从而实现在原核系统中病毒基因的缺失及外源基因的插入。目前较为常用的大肠杆菌基因定位修饰技术主要包括Red/ET介导的同源重组技术、RecA蛋白介导的同源重组技术、Cre/loxP介导的同源重组技术以及Tn转座子介导的随机插入和突变技术。利用分子克隆化技术手段现已获得成熟的细菌人工染色体鸭瘟病毒拯救系统平台，同时利用大肠杆菌基因定位修饰Red/ET介导的同源重组技术可在细菌人工染色体鸭瘟病毒拯救系统平台上进行鸭瘟病毒基因的缺失和外源基因的插入，该成果极大的推动了鸭瘟病毒基因功能的研究进程。

Red/ET介导的同源重组技术是基于λ-噬菌体Red操纵子(Redα/Redβ/Redγ)和Rac噬菌体RecE/RecT同源重组酶的同源重组打靶技术。该技术操作简单、快速、高效，广泛应用于基因缺失、突变工作。但是利用该操作技术进行基因缺失、突变会在缺失或突变位点残留约80bp左右外源碱基序列(FRT位点)，该位点的残留将影响基因功能的准确分析。MiniF元件作为维持BAC载体复制的最小生育力因子复制子，主要由调控BAC复制起点(oriS)的repE、repF基因、调控复制子分配的sopA、sopB基因以及编码着丝粒区域的sopC基因构成。为完成细菌抗性筛选及BAC标记筛选，MiniF元件加入了抗性筛选基因和荧光标记基因。MiniF元件插入病毒基因组，增加基因组长度，对病毒复制产生不确定影响。同时MiniF元件作为细菌序列在病毒基因组上残留，不利于减毒活疫苗的开发和许可。因此解决碱基残留问题并去除MiniF元件获得无痕基因缺失株，已成为探究鸭瘟病毒基因缺失方法的重点。

鸭瘟(Duck Plague，DP)是由α-疱疹病毒亚科中鸭瘟病毒(Duck Plague virus,DPV)引起的鸭、鹅等水禽的急性接触性高度致死性传染病。该病首先由荷兰报道，随即在我国华南、华中和华东等养鸭业较为发达的地区流行，给我国的养鸭业造成了严重的经济损失。因此深入了解鸭瘟病毒基因功能、加强对鸭瘟疫病的研究对确保我国养鸭业健康、可持续发展尤为重要。

Lorf5(Lorf11)、Lorf2、Lorf3、Lorf4(Lorf9)、Sorf3等基因为禽疱疹病毒特有基因，目前关于该类基因的研究报道鲜少，其功能尚不明确。在禽疱疹病毒中仅见于马立克病毒Lorf5基因被报道与病毒毒力相关。鸭瘟病毒Lorf5基因尚未有任何功能报道。但通过序列分析发现Lorf5基因在鸭瘟病毒不同毒株间高度变异，所有六株毒C端的60aa相同且三株弱毒的Lorf5序列100％相同，但弱毒缺失强毒所共有的44aaN端序列。三株弱毒与强毒相比在整个序列中发生了10处插入(共82aa)和1处缺失(3aa)，推测这些变异可能是弱毒在鸡胚上的连续传代导致的突变，指示其与强毒的致弱部分关联，提示Lorf5可能与鸭瘟病毒的毒力相关。因此探究Lorf5基因在鸭瘟病毒生命周期中的作用将为鸭瘟疫病防治工作提供助力。