[发明专利]异源生产线性三萜的方法

说明书

一种采用合成生物学手段发现和异源生产线性三萜的方法，在酿酒酵母细胞异源表达灵芝来源的cyp505d13基因，并对酵母工程菌株的发酵产物进行分离纯化、质谱和核磁共振等分析，确定产生了线性三萜类化合物1、化合物2和化合物3，其中化合物1和2从未见报道。本发明包含从cyp505d13基因的发现，到产物生产鉴定，最终获得异源生物合成的线性三萜类物质等一系列的设计及验证，也为异源生产其它线性三萜类活性物质提供了范例。

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种生物合成线性三萜类化合物的方法。

背景技术

三萜类化合物是分布最广的天然产物，是一类结构多样，成员数目近20000个的C30化合物(Sumit,2016)。根据其结构差异，三萜类化合物可分为线性三萜(角鲨烯型)和环状三萜(如羊毛甾烷型、油烷型、熊烷型、芦丁烷型)。三萜类化合物具有许多有前途的生物活性，包括抗癌、抗氧化、抗炎等(Malwina,2015)。其中许多线性三萜，因含有多个非共轭双键，具有较强抗氧化活性(Farvink,2007)。在提高体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、增强机体免疫力、药物递送和皮肤护理方面都有特别重要的作用(Bindubscm,2015)。因此，高效生产线性三萜引发了学术界和产业界的广泛关注。

线性三萜的前体角鲨烯可通过甲戊酸钠(MVA)(Chappell,1995)或甲基赤藓醇4-磷酸(MEP)(Rohmer,1999)途径产生。角鲨烯形成后，经过一系列后修饰，最终产生结构功能多样的线性三萜，这些后修饰主要由细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)催化完成(Steven,2013)。由于参与线性三萜生物合成的CYP发现和相关研究非常有限，这极大阻碍了它们的高效生产和广泛应用。

蘑菇类真菌含有丰富多样的CYP，并且可以产生多种独特的三萜类化合物，在生态系统和人类营养与健康中发挥着重要作用(Chen W,2014)。然而，由于基因操作的不成熟，其CYP的功能鉴定相对植物和原核生物的相关研究滞后(Hao Q,2017)。为了克服这一局限，我们以酿酒酵母作为筛选宿主，用于筛选参与线性三萜生物合成的关键CYP。选择酿酒酵母的其原因是：(1)酿酒酵母遗传操作简单，背景清楚(Joshua,2018)；(2)它能天然产生线性三萜类化合物的直接前体——角鲨烯(Genlin Zhang,2015)；(3)它具有支持膜蛋白CYP功能的亚细胞器(如内质网)；(4)很少有内源性CYP对外源CYP产生干扰。

发明内容

本发明提出一种生物合成线性三萜类化合物的方法，通过筛选线性三萜生物合成相关的CYP基因，并在酿酒酵母细胞异源表达，从而实现异源合成线性三萜。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一类线性三萜类化合物，其分子式及结构式包括：

化合物1：

化合物2：

化合物3：

本发明涉及一种灵芝线性三萜合成基因，即cyp505d13，其核苷酸序列如Seq No.1所示，氨基酸序列如Seq No.2所示。